Иммунологические и морфологические аспекты диагностики инфекции Helicobacter pylori и вирусов семейства Herpesviridae

Согласно рекомендациям Американской коллегии гастроэнтерологов (2005) и Европейской группы по изучению H.pylori («Маастрихт-3», 2005г.) диагноз инфекции H.p. должен устанавли в аться преимущественно неинвазивными методами диагностики [1].

Несмотря на значительные достижения в диагностике и лечении Н.р.-ассоциированных заболеваний сохраняются проблемы верификации бактерии. Нередко выявление Н.р.-инфекции проводится лишь одним из лабораторных методов. Наиболее популярными являются иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако они не являются абсолютными, дающими максимально объективные результаты.

Достоверная и своевременная диагностика H.p. позволяет избежать необоснованного назначения антибактериальных препаратов, а также адекватно контролировать проводимую антихеликобактерную терапию. Несмотря на большое количество методов определения H.p-инфекции постоянно идет поиск и модификация неинвазивных или малоинвазивных способов диагностики этой инфекции [2, 3].

ткани, ассоциированной со слизистой (MALT), в сочетании с H.p. и в неповрежденной СО [7]. Есть данные о том, что варицелла зостер вирус (ВЗВ) может быть причиной развития необъясненной патологии органов пищеварения, в том числе и гастритов [8].

Не так давно идентифицированы новые вирусы группы герпеса: вирус герпеса 6 типа (ВГЧ-6), – 7 типа (ВГЧ-7) и 8 типа (ВГЧ-8). Роль этих вирусов в патологии человека обсуждается. Однако уже известно, что они играют определенную роль в усилении пролиферативных процессов. Эти вирусы так же обнаруживаются в СО ЖКТ как при патологии, так и в неизмененной ткани [9].

Интересными представляются данные о «вне-желудочных проявлениях», обусловленных инфекцией H.p. Опубликованы результаты клинических и экспериментальных работ, в которых показано присутствие фрагментов генома H.p. в атеросклеротических бляшках кровеносных сосудов [10]. В этой связи представляет определенный интерес изучение вопроса о присутствии фрагментов ДНК H.p. в моно-нуклеарных клетках (МНК).

В связи с вышеизложенным, целью нашего исследования явилось изучение вирусов группы герпеса в СО гастродуоденальной области, а также определение фрагментов ДНК H.p. в МНК периферической крови у пациентов с верифицированной инфекцией H.p.

Присутствие микроорганизма в СОЖ определяли в биопсийном материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием коммерческих наборов «Хеликопол», НПФ «Литех» (Россия) на наличие участков генома H.р.. (ure С, cag A-, vac A-генов). В клеточных суспензиях методом ПЦР определяли фрагменты генома (ure C, vac m1, ice a1, bab a1), кодирующие факторы патогенности микроорганизма (использование тест-систем производства НПФ «Литех»). Ферментативную активность Н.р. в биоптате определяли с помощью уреазного теста «H.pylori Quick Test» (Финляндия).

Для определения иммуноглобулинов в периферической крови, специфических к Н.pylori, использовали ИФА тест-системы Euroimmune ( I g A , IgG) , Германия, и «Хелико-Бест антитела» (суммарные антитела к Cag A белку). Кроме того, методом ПЦР исследовали МНК периферической крови на носительство ДНК Н.рylori с использованием указанных наборов для ПЦР. МНК периферической крови, выделяли на градиенте плотности фиколл-урографин (с=1,077) и разделяли на субпопуляции CD4, CD8, CD25 методом иммуномагнитной сепарации, реактивами фирмы «Dynal» (Норвегия).

Для обнаружения вирусов – ВЗВ, ЭБВ, ЦМВ, вирусов герпеса человека 6,-7,-8 типов (ВГЧ-6,-7,-8) использовали готовые наборы фирм-производителей: «Амплисенс», «Биоком», «Литех», «ДНК-технология» (Москва); «Вектор-Бест» (Новосибирск). Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва).

Статистический анализ результатов исследования проводили с использованием общепринятых методов. Достоверность различий определяли с использованием критерия Краскелла-Уоллеса. Коэффициент корреляции определяли по методу ранговой корреляции Спирмена.

Результаты. При определении специфических антител к H.p. было получено, что группа больных с деструктивными поражениями СОЖ достоверно отличалась от группы с поверхностными изменениями СОЖ по суммарным антителам к Cag A белку (средний индекс позитивности по группам составил 9,4 и 7,5 соответственно, р<0,05). По IgA и IgG отмечалось достоверное различие в зависимости от вида повреждения СОЖ (р< 0,01).

Определение ДНК Н.p в МНК периферической крови дало положительные результаты в 1 группе больных в 20% случаев и во 2 группе – в 49,5 %. При этом, частота определения генов cag A была выше при поверхностном воспалении, а ген vac Аs 1 и vac As2 чаще определялся в группе с деструктивными изменениями (рис. 1).

В МНК периферической крови, полученных от пациентов с различной степенью деструкции (эрозивные и язвенные изменения) СО гастро – дуоденальной зоны, фрагменты генома ure C, ice a1 и bab a1 в общей популяции МНК были обнаружены у всех пациентов. В субпопуляции CD4 фраг м енты ice a1 обнаружены у 42,9%, bab a1 – у 57,1%. В клетк а х с фенотипом CD8 обнаружили фрагмент ice a1 у 42,9%, причем одновременное нахождение этого гена в CD4 и CD8 клет к ах было только в 28,6% случаев. В суспензии клеток с фенотипом CD25 обнаруживали только фрагмент bab a1 у 47,6% пациентов. Одновременное присутствие фрагментов ice a1 и bab a1 в CD4, CD8 и CD25 наблюдалось у 60% пациентов (рис. 2).

Рис. 1 . Частота встречаемости генов патогенности H.p. в МНК периферической крови

Рис. 2. Частота встречаемости фрагментов генома H.p. в субпопуляциях МНК периферической крови

Результаты ПЦР в биоптатах и Quick Test полностью совпадали. Во всех случаях обнаружения H.p. в СО присутствовал фрагмент генома, кодирующий С-субъединицу уреазы (ure C) .

При деструктивных воспалительных процессах (2 группа) наиболее часто определяли наличие более агрессивных штаммов Н.р ( cagA+vacA+). При этом частота обнаружения агрессивных штаммов инфекции имела четкую положительную корреляцию со степенью повреждения СО (r = 0,8). У пациентов с деструкцией СО H.p. был обнаружен у 95% пациентов, из них в 80% случаев определяли ульцероген-ный (cagA+vacA+) штамм. В группе с поверхностным гастритом (1 группа) инфицирование СО H.pylori было обнаружено у 64 % пациентов, однако из них у 35,7 % обнаружили cagA- vacA- штамм Н.р., а cagA-vacA+ и cagA+vacA+ в 13,8 % и 14,5 % соответственно (рис. 3).

Положительные результаты ИФА при отрицательных данных на Н.р., при исследовании биоптата методом ПЦР и Quick Test, были получены у 5 па ц иентов из первой группы (11%) и у 6 – из второй (17,6%), что можно было объяснить следовыми реакциями на ранее перенесенную Н.р. инфекцию.

Рис. 4. Частота встречаемости генов патогенности H.p. в биоптате СОЖ

0Н!»1« В1ИЧ' > О АВ П(ЧЧ* В11ГЧ ? BlU'M QILMK

Рис. 5. Частота обнаружения вирусов Herpesviridae в СОЖ

Рис. 6. Частота обнаружения микроорганизмов при различных типах инфицирования СОЖ

Изучение генов патогенности H.p. в биоптатах показало различную частоту их встречаемости при поверхностных и деструктивных изменениях СОЖ (рис. 4).

При исследовании биопсийного материала, полученного при гастроскопии, методом ПЦР ВПГ-1 и ВПГ-2 ни у одного пациента обнаружено не было. Вероятно, это объясняется небольшим объемом выборки. Частота обнаружения других представителей вирусов герпеса была следующая. У пациентов при отсутствии жалоб со стороны ЖКТ и без изменений СО по данным эндоскопии и гистологических изменений (контрольная группа) были обнаружены только ВЭБ – 10% случаев, а также вирусы герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6) и 7 типа (ВГЧ-7) в 10% случаев каждый. При поверхностном воспалении ВЭБ обнаруживали в 30% случаев, ВГЧ-6 в 44,4% случаев, а вирусы герпеса человека 7 и 8 типов (ВГЧ-7, -8) в 10% случаев соответственно. При деструктивных изменениях СО частота встречаемости составила: ВЗВ – 7,1%, ВЭБ – 17,6%, ЦМВ – 14,3%, ВГЧ-6 – 35,3%. ВГЧ-7 – 32,4%, ВГЧ-8 – 17,5% (рис. 5).

При изучении типа инфицирования СО вирусами герпеса и H.p. были выявлены различные сочетания бактериально-вирусной контаминации и частоты встречаемости микроорганизмов: моноинфицирова- ние H.p., моноинфицирование вирусами герпеса и микст-инфицирование H.p. и одним или несколькими представителям Herpesviridae (рис. 6).

Обсуждение. Данные исследования подтверждают, что ведущий вклад в развитие хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, безусловно, вносит H. p и, в первую очередь, ее патогенные штаммы. Частота их выявления, а так же уровни специфических антител прямо связаны с характером и глубиной поражения СО.

Имеет место несовпадение результатов серологической диагностики хеликобактериоза методом ИФА и исследований биопсийного материала этих же пациентов методами ПЦР и быстрым уреазным тестом (Quick Test). Вероятно, это явление связано со следовыми реакциями на ранее перенесенную Н.р.-инфекцию.

Несомненно, что вирусы герпеса не только принимают участие в патологическом процессе, но и развивают его по провоспалительному типу. Неэффективность традиционных схем эрадикации H.p. в большинстве случаев и достаточно частые рецидивы заболевания могут быть, обусловлены присутствием вирусов в очаге воспаления, которые направляют и развивают воспалительный процесс «по замкнутому кругу», создавая условия, благоприятные для длительной персистенции H.р. и других патогенных микроорганизмов.

Наличие в МНК фрагментов генома H.p., в частности генов, кодирующих экспрессию цитотоксических и адгезивных белков микроорганизма, в настоящее время объяснить достаточно сложно. Тем не менее, этот факт, вероятно, свидетельствует о вовлечении в инфекционный процесс при хеликобактериозе организма в целом, а не ограничивается только поражением СО ЖКТ.

Поскольку известна роль вирусов, в частности вирусов группы герпеса, в патологии ЖКТ и их совместной персистенции с H.p. на СО логично предположение, что вирусы могут являться вектором доставки генетического материала H.p. в мигрирующие иммунокомпетентные клетки. С другой стороны, H.p. может локализоваться на поверхности клеток посредством молекул адгезии ICAM-1, относящегося к суперсемейству иммуноглобулинов и служащего лигандом для в2-интегринов (LFA-1, Mac-1). Известно, что последние экспрессируются на лейкоцитах, эндотелии сосудов, фибробластах, эпителии [9].

Заключение.

• 1.    Данные исследования подтвержда ю т, что ведущий вклад в развитие хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, безусловно, вносит H. p. и, в первую очередь, ее пато г енные штаммы. Частота их выявления, а так же уровни специфических антител прямо связаны с характером и глубиной поражения СО.

• 2.    Несовпадение результатов серологической диагностики хеликобактериоза методом ИФА, ПЦР и быстрым уреазным тестом (Quick Test) связано

• 3.    Нефагоцитирующие клетки (CD4+, CD8+) могут являться носителями участков генома H.p. При этом часть из них является активированными клетками, экспрессирющими рецептор к интерлейкину-2 (CD25+). Аналогичные д анные получены в суспензиях клеток, выделенных из биопсийного материала.

• 4.    H.р. и герпесвирусная инфекция приводят к прогрессирующей деструкции СО гастродуоденальной области, создавая условия, благоприятные для длительной персистенции H.р. и других патогенных микроорганизмов.

• 5.    Вирусы группы герпеса, вероятно, принимают непосредственное участие в патогенезе развития гастритов и язвенной болезни ЖКТ. Чем глубже степень повреждения СО, тем чаще и в более разнообразном сочетании определяются представители Herpesviri-dae и патогенные штаммы H. р.

со следовыми реакциями на ранее перенесенную Н.рylori инфекцию. Обнаружение фрагментов генома H.p. в МНК возможно отражает системную реакцию организма на H.p.