Иммунологические показатели как прогностические маркеры исхода суставсберегающих операций у детей с ишемическими деформациями проксимального отдела бедра (предварительные результаты)

данным литературы, при прогрессировании артроза может отмечаться изменение уровня цитокинов и иммуноглобулинов, а также нарушение баланса популяций и субпопуляций лимфоцитов [5, 6, 7, 8, 9].

Цель исследования – уточнение особенностей иммунологического статуса у детей с ишемическими деформациями проксимального отдела бедра с учетом исхода лечебного процесса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучены результаты иммунологического обследования 16 пациентов с ишемической деформацией проксимального отдела бедра. Обследование проведено перед выполнением оперативного вмешательства. Возраст детей варьировал от 12 до 16 лет (14,4 ± 0,45 года). Мальчиков было 12, девочек – 4.

Критерии включения: деформация проксимального отдела и головки бедра, развившаяся вследствие болезни Пертеса, отсутствие рентгенологических признаков коксартроза, I–II степень дислокации головки бедра, отсутствие сопутствующей соматической патологии, способной оказать влияние на результаты иммунологического исследования.

Критерии исключения: рентгенологические признаки артроза (субхондральный склероз, сужение суставной щели, кистовидная перестройка), деформация проксимального отдела, обусловленная септическим кокситом или асептическим некрозом другой этиологии, III степень дислокации головки бедра; рентгенологические признаки фемороацетабулярного импиджмента после выполнения реконструктивного вмешательства, наличие соматической патологии.

Для оценки функционального состояния больных до и после лечения применяли систему Merle d'Aubigne-Postel. Рентгенологические показатели оценивали по критериям Tonnis, Severin. Во всех наблюдениях выявлена деформация проксимального отдела бедра в виде укорочения шейки, высокого расположения большого вертела, патологического отклонения головки. В 12 случаях отмечено уплощение и нарушение ориентации вертлужной впадины. Нарушение суставных соотношений соответствовало I–II степени. Применялись только внесуставные операции. Во всех наблюдениях произведено реконструктивное вмешательство на проксимальном отделе бедра (двойная чрезвертельная остеотомия). В 12 случаях она дополнена остеотомией таза. Срок наблюдения составил 18–24 месяца. В результате оперативного вмешательства во всех наблюдениях восстановлены суставные соотношения, улучшена форма проксимального отдела бедра. Все суставы соответствовали IIа типу по Severin. В четырех случаях выявлено прогрессирование артроза (на 1 уровень). У этих пациентов отмечено ухудшение подвижности сустава в сравнении с исходным уровнем. В зависимости от анатомо-функционального исхода пациенты разделены на 2 группы.

В первую (I) группу включено 12 пациентов, средний возраст которых был 14,7 ± 0,6 года. В 10 случаях отмечена II степень дислокации, в двух – I ст. Перед операцией средний показатель болевого синдрома составил 4,2 ± 0,2 балла, подвижности сустава – 4,6 ± 0,2 балла, нарушения походки - 4,4 ± 0,15 балла. Реконструкция обоих суставных компонентов выполнена в 10 наблюдениях, вмешательство только на бедренной кости – в двух случаях. При оценке функциональных исходов отмечено улучшение всех показателей: болевой синдром – 5,7 ± 0,2 балла, нарушение сустава – 5,25 ± 0,3 балла, нарушение походки 5,4 ± 0,2.

Вторую (II) группу составили 4 пациента в возрасте 13–15 лет (14 ± 0,4). Распределение суставов по степени смещения головки: I ст. – 2, II ст. – 2. Функциональные нарушения до операции: боли – 4,25 ± 0,5 балла, ограничение движений – 4,25 ± 0,5 балла, нарушение походки – 4,5 ± 0,5. Реконструкция обоих суставных компонентов произведена в двух случаях. Операция только на бедре выполнена у двух пациентов. При оценке функциональных исходов отмечено ухудшение подвижности сустава в сравнении с исходным (3,5 ± 0,5) и незначительное снижение среднего показателя походки (4,25 ± 0,5). Интенсивность болевого синдрома не изменилась (4,25 ± 0,5 балла). При рентгеновском обследовании у пациентов данной группы отмечены признаки артроза в виде склероза субхондральных отделов, кистовидной перестройки и сужения суставной щели.

Исследование популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови было проведено методом проточной лазерной цитометрии на цитометре «BECKMAN COULTER EPICS XL» (США), применялись моноклональные антитела «Immunоtech» (Франция). Определение сывороточных концентраций IgА, IgМ, IgG, IgE, IL-18, IFN γ , ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов) осуществлялось методом ИФА на иммуноферментном анализаторе BIO-TEK Instruments Inc, ELx808 (CША). Использовался набор реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Кислородпродуцирую-щие свойства нейтрофилов оценивали при помощи НСТ–теста по методу Park в двух вариантах: спонтанном и стимулированном, с использованием в качестве стимулятора микробной тест-культуры Staphylococcus epidermidis (штамм № 9198 «НИИЭМ» СЗО РАМН). Лизосомальную активность нейтрофильных фагоцитов (миелопероксидазы и катионных белков) определяли цитохимическими методами. Использовали методику Грехема – Кноля для выявления миелопероксидазы и метод М.Г. Шубича с бромфеноловым синим для выявления катионных белков в нейтрофилах крови. Использовали полуколичественную оценку результатов, полученные значения выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Для подсчета NETs (внеклеточных нейтрофильных ловушек) использовали мазки крови, применялась окраска по Романовскому–Гимзе. Методика включала подсчет процента нейтрофилов, которые прошли стадию трансформации ядра (стадии 1а и 1в), а также выбросивших во внеклеточное пространство свободный хроматин в виде сетеподобных структур (зрелые NETs) [10]. Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов и подсчет экстрацеллюлярных нейтрофильных ловушек проводилось с помощью светового микроскопа Axio Lab.A 1 (Karl Zeiss MicroImaging GmbH; объектив 100 (МИ), окуляр 12,5×) с использованием иммерсии.

Полученные результаты были сопоставлены с данными контрольной группы (КГ), состоящей из 14 относительно здоровых подростков (10 мальчиков и 4 девочки) в возрасте 14,3 ± 0,6 года. Статистическая обработка проводилась с помощью программного обеспечения AtteStat, выполненного в качестве надстройки к «Microsoft Exсel». Результаты исследования представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей. Применялся непараметрический U-критерий Манна–Уитни.

На проведение иммунологических исследований было получено информированное согласие без идентификации личности от законных представителей подростков. На проведение клинических исследований было получено разрешение комитета по этике ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание Т-лимфоцитов (CD3+CD19-) и В-лимфоцитов (CD3-CD19+) в обеих группах достоверно не отличалось от контрольных показателей (табл. 1). В обеих группах, в сравнении с контрольными значениями, отмечалось статистически значимое снижение количества натуральных киллеров (CD3-CD16+CD56+), уровня IL-18, повышение концентрации IgE, спонтанного НСТ-теста, миелопероксидазы, катионных белков и количества экстрацеллюлярных нейтрофильных ловушек (табл. 2, 3, 4). Кроме того, от показателей контроля группа I отличалась повышением концентраций иммуноглобулинов классов А и G. В группе II, в сравнении с контрольными значениями, наблюдалось снижение содержания Т-хелперов (CD3+CD4+), повышение относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), увеличение количества Т-лимфоцитов с маркерами активации (CD25 и HLADR), снижение числа активированных NK-клеток (CD8dimCD38+), снижение уровня иммуноглобулинов основных классов и стимулированного HСТ-теста.

Таблица 1

Показатель		I	II	Контрольная группа (КГ)
Т-лимфоциты CD3 + CD19	%	78,8 (76,8–80,0)	75,7 (73,1–79,0)	71,0 (68,4–73,6)
	109/л	1,57 (1,32–1,76)	1,21 (1,19–1,71)	1,46 (1,33–1,67)
Т-хелперы CD3 + CD4 +	%	49,4 p = 0,01 (44,8–51,3)	35,4* (35,0–36,8)	42,6 (41,1–45,5)
	109/л	0,86 p = 0,039 (0,77–1,0)	0,66* (0,58–0,84)	0,86 (0,82–1,08)
Цитотоксические Т-лимфоциты CD3 + CD8 +	%	28,8 p = 0,026 (21,6–32,1)	40,3* (35,7–44,65)	27,0 (25,5–29,17)
	109/л	0,51 (0,41–0,71)	0,7 (0,61–0,94)	0,61 (0,5–0,7)
В-лимфоциты CD3 CD19 +	%	13,6 (12,6–16,5)	14,0 (10,3–14,7)	12,6 (11,7–15,3)
	109/л	0,36 (0,23–0,4)	0,25 (0,17–0,32)	0,27 (0,25–0,3)
Натуральные киллеры CD3-CD16+CD56 +	%	7,0* (4,0–10,5)	9,0* (8,5–10,0)	13,5 (11,3–16,5)
	109/л	0,11* (0,08–0,18)	0,19* (0,16–0,21)	0,29 (0,25–0,36)
CD3 + HLADR (поздняя активация Т-лимфоцитов)	%	1,65 p = 0,045 (1,3–1,9)	2,3* (2,2–2,4)	1,8 (1,3–2,17)
	109/л	0,039 p = 0,049 (0,026–0,046)	0,053* (0,047–0,06)	0,036 (0,03–0,042)
CD3 + CD25 + (ранняя активация Т-лимфоцитов)	%	1,4 p = 0,044 (1,2–1,8)	2,9* (2,0–3,8)	1,7 (1,3–2,0)
	109/л	0,041 (0,032–0,052)	0,057* (0,044–0,07)	0,037 (0,02–0,04)
CD8brightCD38+	%	2,33 p = 0,027 (1,67–2,57)	4,6 (3,0–6,0)	3,26 (2,4–3,87)
CD8dimCD38 +	%	0,82 p = 0,049 (0,54–0,92)	0,42* (0,38–0,56)	0,89 (0,55–1,191)
Иммунорегуляторный индекс (CD4 +/ CD8 * )		1,66 p = 0,02 (1,58–1,88)	0,88* (0,8–1,08)	1,57 (1,48–1,78)

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3, 4: P – обозначена статистическая значимость отличий между I и II группами; * – статистическая значимость отличий от показателей контрольной группы (p < 0,05).

Таблица 2

Показатель	I	II	Контрольная группа (КГ)
IFN γ (пг/мл)	4,8 p = 0,038 (3,49–6,3)	2,0 (1,5–2,89)	3,5 (2,0–4,8)
IL-18 (пг/мл)	185,6* (155,9–203,17)	208,7* (200,0–217,6)	258,5 (235,8–274,2)

Таблица 3

Показатель	I	II	Контрольная группа (КГ)
НСТ-спонт. (%)	18,0* (14,0–25,7)	17,0* (13,5–18,5)	8,0 (7,0–9,0)
НСТ стим. (%)	75,0 p = 0,026 (63,0–80,0)	60,0* (60,0–67,0)	80,0 (78,0–81,0)
ИС НСТ	3,9* (2,9–4,6)	3,5* (3,25–5,45)	9,3 (8,9–10,0)
Миелопероксидаза (СЦК)	2,8* (2,5–2,9)	2,6* (2,55–2,7)	2,3 (2,2–2,4)
Катионные белки (СЦК)	2,6* (2,5–2,75)	2,6* (2,55–2,65)	2,15 (2,0–2,3)
NETs (общее колличество) (%)	5,5* (5,0–8,0)	10,0* (8,0–10,5)	2,0 (2,0–3,7)
Ранние NETs (стадия1а) (%)	4,0* (2,75–5,0)	5,0* (3,5–5,5)	1,0 (1,0–2,0)
Ранние NETs (стадия 1б) (%)	1,0 (0,0–2,0)	2,0 (1,0–2,0)	0,5 (0,0–1,5)
NETs (зрелые) (%)	2,0 (1,01–2,0)	2,0* (2,0–3,0)	1,0 (0,0–1,0)

Таблица 4

Показатели гуморального иммунитета

Показатель	I	II	Контрольная группа (КГ)
IgA (мг/мл)	2,91 p = 0,0072 * (2,5–3,9)	1,0* (0,84–1,05)	1,52 (1,12–1,67)
IgM (мг/мл)	2,57 p = 0,015 (1,69–3,0)	1,0* (0,9–1,05)	1,6 (1,29–2,1)
IgG (мг/мл)	20,0 p = 0,045 * (14,75–22,3)	9,8 (8,1–12,7)	13,0 (10,0–15,1)
IgЕ (мМЕед)	13,78* (6,93–22,75)	31,3* (27,6–35,0)	4,2 (0,6–7,8)
ЦИК (у.е.)	23,0 p = 0,048 (11,0–33,0)	34,0* (31,0–55,0)	18,5 (13,25–30,0)

Показатели клеточного иммунитета

Содержание сывороточных концентраций IFN γ и IL-18

Показатели фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов

Сравнительный анализ показателей клеточного иммунитета в группах I и II выявил статистически значимое снижение количества Т-хелперов (СD3+СD4+), повышение относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов (СD3+СD8+), увеличение количества активированных Т-лимфоцитов (СD3+CD25 и СD3+HLADR, СD8brightCD38+), уменьшение количества активированных

NК-клеток (СD8^dimCD38⁺) и уровня IFN γ в группе II. Исследование показателей гуморального иммунитета показало снижение концентрации IgA, IgM, IgG и повышение уровня ЦИК в группе II, в сравнении с группой I. Кроме того, достоверно значимые отличия были выявлены в отношении стимулированного HСТ-теста, значения которого были ниже в группе II.

ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы были собраны убедительные доказательства участия Т- и В-клеток в остеокластогенезе и разрушении костной ткани [11, 12]. Имеются сообщения о связи идиопатического аваскулярного некроза головки бедренной кости с функциональной недостаточностью не только клеточного, но и гуморального иммунитета [13].

Согласно литературным источникам, остеонекроз нетравматического генеза у взрослых пациентов сопровождается уменьшением количества Т-лимфоцитов за счет снижения количества Т-хелперов с соответствующим понижением иммунорегуляторного индекса [14]. Есть опубликованные данные, что процентное содержание Т-лимфоцитов коррелирует со стадией остеонекроза (чем боле выражен патологический процесс, тем ниже CD3+) [15]. Мы не выявили снижения Т-лимфоцитов у подростков с ишемической деформацией проксимального отдела бедра. При этом в группе с прогрессированием артроза наблюдалось снижение иммунорегуляторного индекса, обусловленное снижением количества Т-хелперов и повышением количества цитотоксических Т-лимфоцитов, а в группе с хорошими результатами лечения субпопуляции Т-лимфоцитов находились в пределах нормы.

В группе с неудовлетворительными результатами лечения были выявлены более низкие концентрации IFN γ , чем в группе с благоприятным исходом лечения. Из литературных источников известно, что IFN γ оказывает влияние на образование, а также на дифференцировку остеобластов посредством активации остеогенных факторов. Кроме того, данный цитокин способен ингибировать раннюю дифференцировку остеокластов [16, 17, 18]. Следовательно, можно предположить, что снижение экспрессии IFN γ при аваскулярном остеонекрозе является неблагоприятным фактором.

В обеих группах мы наблюдали усиление кислородза-висимой и лизосомальной активности нейтрофилов, что совпадало с литературными данными [19]. В обеих группах, в сравнении со значениями контроля, отмечалось достоверное увеличение количества нейтрофильных экс- трацеллюлярных ловушек, обусловленное остеонекрозом. Отличия между группами заключались в снижении значений стимулированного НСТ-теста во II группе, что свидетельствовало о снижении резервного потенциала фагоцитов у пациентов с прогрессированием артроза.

В литературе имеются указания на повышение концентраций сывороточных иммуноглобулинов при болезни Пертеса [20]. В других работах приводятся данные о повышенных концентрациях IgM при нормальном содержании IgG и сниженном уровне IgA при данной патологии, а также о нормализации концентраций иммуноглобулинов после курса консервативного лечения [21]. Согласно нашим данным, в группе I наблюдалась умеренная активация, а в группе II – недостаточность гуморального иммунитета.

Известно, что при наличии исходных иммунных нарушений риск развития послеоперационных осложнений и неблагоприятных исходов хирургического лечения усиливается [22]. Степень тяжести иммунных расстройств оказывает влияние на развитие осложнений, как инфекционных, так и неинфекционных [23]. Кроме того, само по себе оперативное вмешательство, являясь стрессом для организма, оказывает дополнительное неблагоприятное воздействие на иммунную систему [24]. В литературных источниках имеются указания на отклонения исходных иммунологических показателей у взрослых пациентов с остеонекрозом и их динамику на фоне проводимого лечения. В частности, описывается высокий уровень IgG, ЦИК и В-лимфоцитов в доопера-ционном периоде и нормализация данных показателей после эндопротезирования суставов. В связи с чем авторы предлагают использовать эти показатели в качестве маркеров эффективного лечения [25]. Мы не встретили работ, в которых у подростков с ишемическими деформациями проксимального отдела бедра исходное состояние иммунитета было бы сопоставлено с результатами хирургического лечения. Между тем наши исследования показывают, что такая взаимосвязь имеется.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно результатом проведенных исследований, хороший анатомо-функциональный исход хирургического лечения был достигнут в случае отсутствия дооперационных нарушений со стороны показателей клеточного иммунитета и умеренной активации гумо- рального иммунитета. У подростков с неблагоприятным анатомо–функциональным результатом выявлены отклонения показателей клеточного и гуморального иммунитета (дисбаланс субпопуляций Т-лимфоцитов, обусловленный снижением количества Т-хелперов (CD4+)

и повышением доли активированных Т-лимфоцитов, снижение концентраций иммуноглобулинов основных классов, повышение уровня IgЕ и ЦИК, снижение выработки IFNγ). Это позволяет предположить, что недостаточность клеточного и гуморального иммунитета может указывать на возможность неблагоприятного исхода применения суставсберегающего оперативного вмеша- тельства. Иммунологические показатели (субпопуляции Т-лимфоцитов, иммуноглобулины, ЦИК, IFNγ) могут быть использованы в качестве дополнительных прогностических критериев при планировании оперативного вмешательства и последующего реабилитационного периода у подростков с ишемическими деформациями проксимального отдела бедра.