Иммуностимулирующий эффект препаратов-биорегуляторов при обработке клубней картофеля

Органическое или экологическое земледелие относится к новым перспективным формам сельского хозяйства, при котором приоритетным является сохранение природных ресурсов и естественных связей в биоценозах. Актуальной задачей является использование биологических и экологически безопасных средств, способствующих увеличению урожая и повышению устойчивости растений к различным неблагоприятным факторам среды.

В настоящее время использование различных препаратов-биорегуляторов относится к перспективному направлению биологической защиты растений [4, 14]. Иммуно- и ростстимулирующее действие таких препаратов обусловлено сбалансированным комплексом природных биологически активных веществ, обладающих элиситорными свойствами, т.е. способных взаимодействовать со специфическими рецепторами клеток растений и активировать механизмы естественной защиты растительного организма [5, 9].

Известно, что важной составляющей защитного ответа растений является образование соединений, подавляющих активность чужеродных ферментов [3, 6]. Агрессивность и патогенность микроорганизмов, насекомых – вредителей, в значительной степени определяется активностью их гидролитических ферментов, в частности, протеиназ [10]. Соответственно, высокая активность ингибиторов этих ферментов, является одним из факторов устойчивости растений к действию грибных патогенов и насекомых-вредителей [7, 8]. Искусственное регулирование уровня активности ингибиторов протеолитических ферментов в растительных тканях может служить одним из способов стимулирования естественных механизмов устойчивости растений [5, 12]. В связи с этим, исследование изменения уровня активности ингибиторов в органах и

Шпирная Ирина Андреевна , канд. биол. наук,

тканях растений под действием препаратов-биорегуляторов представляет научный и практический интерес.

Целью настоящей работы являлось выявление изменений уровня активности белков ингибиторов, подавляющих действие трипсина и протеиназ личинок колорадского жука (ЛКЖ) в клубнях картофеля, обработанных препаратами-биорегуляторами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили клубни картофеля ( Solanum tuberosum ) сорта Ред Скарлетт. Покоящиеся клубни обрабатывали путем опрыскивания 0,001% -ми растворами препаратов: Циркон, Рифтал, Эпин-экстра, Фитоспорин-М. Используемая концентрация препаратов была определена по результатам предыдущих опытов как наиболее оптимальная [12].

При 1-кратной обработке клубни опрыскивали и отбирали образцы на 4-, 7-, 10-е сут. Повторную обработку клубней производили с 3-суточным интервалом, образцы для исследований отбирали после 2- и 3-кратной обработки. В качестве контроля использовали клубни, обработанные дистиллированной водой.

Для получения экстрактов с ингибирующей активностью навеску центральной части клубней гомогенизировали с кварцевым песком, экстрагировали охлажденной дистиллированной водой (1:4) в течение 1,5 ч, осадок отделяли на центрифуге МРW-310 (Польша) при 10000 об./мин, в течение 10 мин, использовали супернатант.

Ферментные препараты протеиназ выделяли из личинок колорадского жука, следующим образом: навеску замороженных личинок колорадского жука растирали с кварцевым песком, заливали дистиллированной водой в соотношении 1:4. Оставляли экстракт на 1,5 ч при 40С, далее фильтровали и дважды центрифугировали при 10000 об./мин в течение 10 мин. Использовали супернатант.

Активность ингибиторов протеиназ определяли спектрофотометрически, по гидролизу синтетического субстрата БАПНА (N,α-бензоил-DL-аргинин-

4-нитроанилид HCl [2,16] и по гидролизу желатины, иммобилизованной в агарозный гель [13]. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [15]. Эксперименты проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях. В качестве величины погрешности использован доверительный интервал выборочного среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одним из факторов, определяющих характер физиологического воздействия препаратов на растение, является их состав. В связи с этим представляет интерес исследование препаратов различных по происхождению и химической природе. Так, действующими веществами препаратов Циркон и Эпин-экстра являются соединения, участвующие в метаболизме растительного организма (гидрокси-коричные кислоты и 24-эпибрассинолид соответственно); Фитоспорин-М является бактериальным препаратом (содержит эндофитный штамм бактерий Bacillus subtilis 26 Д). Данные препараты являются эффективными биорегуляторами и широко используются в растениеводстве.

На рис. 1 представлены результаты измерения трипсинингибирующей активности экстрактов клубней после обработки их препаратами. Как видно, все исследуемые препараты изменяют уровень активности ингибиторов трипсина в тканях клубней. По истечении 4 и 7 сут эксперимента (соответственно после 1- и 2-кратной обработок) уровень активности ингибиторов трипсина в клубнях значительно ниже, чем в контрольных клубнях. Однако, на 10 сут (после 3 обработок), активность ингибиторов в клубнях значительно возрастает, по сравнению с контролем более чем в 4 раза. После обработки препаратами Циркон и Фитоспорин-М активность ингибиторов в клубнях возрастает постепенно по мере повышения числа обработок. Действие препарата Эпин-экстра отличается от действия других исследуемых препаратов. Видно, что 1-кратная обработка клубней этим препаратом вызывает резкое снижение уровня ингибиторной активности в них, при 3-кратной обработке наблюдается резкое повышение этого показателя по сравнению с другими вариантами опыта (рис., А). Можно предположить, что степень физиологического эффекта препаратов обуславливается их химической природой.

Рис. Активность ингибиторов трипсина в клубнях картофеля при обработке препаратами-биорегуляторами. А) - повторные обработки, Б) - однократная обработка.

Примечательно, что в контрольном варианте наблюдалось значительное понижение активности ингибиторов трипсина со временем. Возможно, это связано с тем, что прорастающие клубни характеризуются снижением ингибиторов протеиназ в тканях, поскольку эти белки активно транспортируются в проростки (глазки) [1].

В дальнейшем исследовали динамику изменений ингибиторной активности в клубнях после однократной обработки препаратами (рис., Б). Как видно, в отличие от предыдущего эксперимента, активность ингибиторов трипсина в обработанных клубнях не превышает значений контрольного варианта. Можно предположить, что в этом случае препараты оказывают на прорастающие клубни стрессовое воздействие. Исходя из полученных результатов, в течение 7 сут после 1-кратной обработки мы наблюдаем начальную фазу стрессовой реакции, которая в наших опытах проявляется в снижении уровня активности ингибиторов трипсина. На 10 сут, по-видимому, в клубнях активируются механизмы, повышающие их устойчивость к стрессовым факторам (фаза резистентности), что проявляется повышением ингибиторной активности до уровня контрольного варианта.

Как было отмечено, в экспериментах с повторными обработками повышение активности ингибиторов трипсина в клубнях наблюдается уже на 7 сут (после второй обработки). По-видимому, первичная обработка препаратами является для растительного организма стрессом, который вызывает комплекс неспецифических ответных реакций, и проявляется, в частности, понижением уровня активности ингибиторов протеолитических ферментов. Последующие обработки включают адаптационные механизмы растений к стрессовому воздействию. Соответственно, повышенный уровень ингибиторной активности после 3 обработок может рассматриваться как эффект сенсибилизации тканей клубней, с последующей иммуностимуляцией растений картофеля. Известно, что для достижения состояния сенсибилизации клубней картофеля необходим достаточно длительный промежуток времени, в течение которого происходит перестройка ультраструктурного аппарата клетки [9]. В наших экспериментах данный эффект начинает проявляться после 2-й обработки (на 7 сут). Проявление эффекта сенсибилизации указывает на то, что повторная обработка препаратами может выступать для растительного организма в качестве эустресса -стимулирующего, мобилизующего стресса [11].

По аналогичной схеме были проведены эксперименты по определению активности ингибиторов протеолитических ферментов ЛКЖ из тканей обработанных клубней.

Обработка клубней картофеля препаратами-биорегуляторами изменяет активность ингибиторов протеиназ ЛКЖ (табл.).

Таблица. Активность ингибиторов протеиназ ЛКЖ в клубнях картофеля при обработке препаратами-биорегуляторами (субстрат желатина)

Варианты опыта	1*		2**		3***
	ИЕ/г массы	ИЕ/мг белка	ИЕ/г массы	ИЕ/мг белка	ИЕ/г массы	ИЕ/мг белка
Контроль (вода)	10,8 ± 1,95	14,82 ± 3,07	6,69 ± 1,07	9,18 ± 3,1	0,94 ± 0,07	1,15 ± 0,08
Фитоспорин-М	9,81 ± 0,6	12,95 ± 1,33	6,14 ± 3,14	8,45 ± 4,54	2,22 ± 0,18	3,22 ± 0,27
Циркон	11,31 ± 0,96	15,18 ± 0,3	7,75 ± 1,2	9,69 ± 0,64	1,39 ± 0,1	1,8 ± 0,14
Эпин-экстра	6,68 ± 2,1	8,15 ± 2,56	7,75 ± 1,2	9,14 ± 0,64	1,48 ± 0,06	1,83 ± 0,1

Прим.: 1- 4; 2- 7; 3 - 10 сут после обработки; *- одно-, **двух-***- трехкратная обработка препаратами

Уровень активности изучаемых ингибиторов в вариантах с Фитоспорином и Цирконом на 4 сут выявляется на уровне контрольного варианта. Обработка Эпином приводит к снижению ингибиторной активности. На 7 сут (после 2-й обработки) в клубнях, обработанных Эпином-экстра, происходит повышение активности ингибиторов протеиназ ЛКЖ.

Ингибиторная активность в клубнях, обработанных Цирконом, на протяжении всех экспериментальных дней превышает значения контроля.

Из результатов видно, что иммунизирующий эффект препаратов (по активности ингибиторов ЛКЖ) проявляется менее интенсивно, по сравнению с предыдущими опытами (по активности ингибиторов трипсина).

Мы предполагаем, что это связано с высокой степенью молекулярной и физиологической гетерогенности протеолитических ферментов колорадского жука. По-видимому, спектр протеиназ ЛКЖ включает различные типы ферментов, в т.ч. способных гидролизовать защитные белки клубней.

Таким образом, обработка клубней картофеля препаратами-биорегуляторами оказывает влияние на активность соединений ингибирующих действие трипсина и протеиназ ЛКЖ.

Однократная обработка снижает уровень активности ингибиторов трипсина, повторная обработка клубней приводит к повышению данной активности.

Обнаруженный нами эффект повышения антипротеолитической активности в тканях может рассматриваться как один из механизмов повышающих неспецифическую устойчивость растений к биотическим факторам, прежде всего к патогенным организмам и насекомым-вредителям.

Работа выполнена при поддержке ФЦП “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 2009-2013 годы (ГК № 16.740.110061); ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития    научно технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК № 16.512.11.2014).