Иммуносупрессорная и противоопухолевая активности различных популяций костномозговых клеток

НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Проблема актгивации противоопухолевого ответа как способа терапии онкологических заболеваний по-прежнему остается открытой. Одним из недостаточно исследованных ее аспектов является изучение роли естественных супрессорных клеток (ЕСК). ЕСК представляют собой популяцию гемопоэтических клеток, гетерогенную как по степени зрелости., так и по принадлежности к росткам кроветворения. Они обладают неспецифическим иммуносупрессорным действием (подавляют митоген- и антиген-индуциро-ванную пролиферацию Т- и В-лимфоцитов). Известно, что при опухолевом росте активность ЕСК значительно возрастает, они мигрируют из костного мозга в селезенку и опухолевый узел. Показано, что из-за своей иммуносупрессорной активности ЕСК играют негативную роль при опухолевом росте, удаление их из организма приводило к торможению роста опухоли вплоть до ее регресса [18, 19].

ЕСК обладают также способностью подавлять пролиферацию ряда опухолевых клеток in vitro [14, 17]. Противоопухолевая активность ЕСК изучена мало. Имеются данные о том, что в условиях in vivo возрастание активности этих клеток сопровождалось элиминацией опухолевого очага [12]. В литературе последних лет на моделях опухолевого процесса всё чаще обнаруживается в качестве иммуносупрессорного фактора ЕСК оксид азота [1, 3, 8,10], в то время как о противоопухолевых медиаторах информации нет, показано только, что в основе противоопухолевого действия ЕСК лежит МО-не-зависимый механизм [2, 14].

Данные сравнительных исследований in vitro иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей разных популяций миелокариоцитов в зависимости от степени их обогащения незрелыми клетками хотя и представлены в литературе, но фрагментарны и противоречивы [15,17]. Больше известно о ЕСК костного мозга и селезенки в период восстановления гемопоэза после ведения циклофосфана, когда происходит значительное увеличение относительного содержания незрелых гемопоэтических клеток [4, 5, б, 9, 11, 13, 16]. При этом было установлено, что иммуносупрессорный эффект ЕСК в такой экспериментальной ситуации усиливался, а противоопухолевый не изучался.

Целью данной работы явилось сравнение иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей клеточных популяций костного мозга, полученных с использованием разных способов обогащения их незрелыми гемопоэтическими клетками как in vitro (удаление прилипающих к пластику клеток, фракционирование по плотности и длительное культивирование), так и in vivo (в период восстановления гемопоэза после ведения циклофосфана), а также определение участия оксида азота в этих активностях.

Материалы и методы

Б работе использовано 36 мышей линии С57В1/6 и 12 мышей DBA/2 обоего пола в возрасте 8—10 нед, полученных из коллекционного фонда НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Животные соответствовали 1-й категории (согласно сертификату), содержались в неполной барьерной системе, имели постоянный доступ к воде и пище (кипяченая питьевая вода, подкисленная соляной кислотой до рН 4-4,5, стерилизованный гранулированный корм). Опухоль Р-815 (мастоцитома) поддерживали в асцит- ной форме на самцах линии DBA/2. Цикло-фосфан вводили мышам линии С57Б1/6 внутрибрюшинно по 125 мг/кг массы тела в 0,1 мл дистиллированной воды.

Для получения клеточных суспензий животных забивали цервикальной дислокацией, мие-локариоциты получали перфузией бедренной и большеберцовой костей, спленоциты получали гомогенизацией селезенок, опухолевые клетки выделяли из асцитной жидкости. Клетки ресус-пендировали в культуральной среде следующего состава: RPMI1640 (Sigma) с добавлением 10% ЭТС (ICN), 20 мМ HEPES, 0,05 мМ 2-меркап-тоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глютамина. Культивирование проводили в атмосфере с 5% СО, и абсолютной влажности. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Прилипающие к пластику клетки удаляли культивированием миелокариоцитов в течение 16 ч в пластиковых чашках Петри диаметром 90 мм ("Costar") в концентрации 3-5хЮ6/мл. Затем неприлипшие клетки собирали, отмывали и ресуспендировали в свежей среде. Фракци-онирование,клеток по плавучей плотности про-[ водили с использованием Перколла (Pharmacia, Швеция). На раствор Перколла с плотностью

1,075 г/мл осторожно наслаивали суспензию клеток. После 15-минутного центрифугирования при 400g клетки, сформировавшие кольцо, собирали, трижды отмывали, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность.

Продукцию NO оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [7]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объемом супериатанта и измеряли абсорбцию при длине волны 550 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.

Оценка иммуносупрессорной активности проводилась по способности подавлять пролиферацию клеток-мишеней — сингенных спленоцитов, активированных митогеном. Для этого клетки-эффекторы (миелокариоциты) культивировали 60—64 ч в 9б-луночных планшетах совместно с клетаами-мишенями (2х105 на лунку) в различных соотношениях в присутствии конканавали-на A (Sigma, 4 мкг/мл). За 16 ч до окончания культивирования вносили по 0,5 мкКю/лунку 3Н-ти-мидина. Затем содержимое лунок переносили на стекловолокнистые фильтры и оценивали включение изотопа на р-счетчике "Mark—ИГ'. Про-