Иммунотерапия меланомы

Меланома относится к группе наиболее агрессивно протекающих злокачественных новообразований и характеризуется крайне неблагоприятным прогнозом. За последние 50 лет по всему миру увеличилась частота заболеваемости меланомой кожи (МК). Химиотерапия дакарбазином позволяет добиться объективных ответов в 10 % случаев, но не приводит к увеличению выживаемости больных диссеминированной меланомой [1]. Высокая смертность и низкая эффективность лечения связаны с ранним метастазированием и толерантностью МК к системной терапии [2].

Высокая иммуногенность клеток меланомы, обусловленная экспрессией ряда поверхностных антигенов, в некоторых случаях может приводить к индукции стойкого противоопухолевого иммунного ответа и, как следствие, спонтанной регрессии первичной меланомы. Кроме того, результаты лабораторных исследований показывают обильную лимфоцитарную инфильтрацию (α/β Т-лимфоциты) ткани опухоли, что также свидетельствует об активации Т-клеточного иммунного ответа против клеток меланомы. Показано, что лимфоциты, выделенные из опухолевого очага, обладают способностью лизировать аутологичные опухолевые клетки ex vivo [3]. Гораздо чаще меланома способ- на уходить из-под иммунологического надзора, увеличиваясь в объеме и формируя отдаленные метастазы.

Цитокины

Впервые противоопухолевый потенциал для цитокинов интерлейкин-2 (IL-2) и интерферон альфа (IFN-α) был показан в 1990 г. В результате ΙΙ фазы клинических испытаний с использованием IL-2 объективного ответа удалось достичь у 16 % пациентов с метастатической меланомой [4, 5].

В лечении онкологических заболеваний цитокины главным образом используются в адъювантном режиме. В настоящее время Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (FDA) для терапии некоторых онкологических заболеваний были одобрены цитокины: IFN-α, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), гранулоцитарно-макрофагеальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и IL-2. В 1998 г. IL-2 был одобрен для терапии метастатической меланомы. В результате клинических испытаний в группах больных меланомой при введении высоких доз IL-2 объективный клинический ответ наблюдался в 4–6 %. Кроме того, показано увеличение уровня безрецидивной и

общей выживаемости больных, получавших IL-2 в режиме монотерапии. Существенным недостатком, ограничившим широкое использование IL-2, стало развитие серьезных побочных эффектов, влияющих на качество жизни.

IFN-α также показал свою эффективность в клинических испытаниях на пациентах с метастатической меланомой. В результате 14 рандомизированных исследований на более чем 8000 больных меланомой было показано увеличение уровня безрецидивной и общей выживаемости [6]. Ограничения использования IFN-α в режиме монотерапии обусловлены непродолжительностью действия. Степень выраженности побочных эффектов (лихорадка, головная боль, кишечные расстройства) зависит от дозы препарата и наблюдается у 80 % пациентов, психические расстройства в виде депрессий появлялись в 45 % случаев [7]. Высокий риск развития побочных эффектов мешает использовать терапию на основе цитокинов.

Ингибиторы тирозинкиназ

Молекулярно-генетические исследования показали, что разнообразие форм меланомы во многом обусловлено её генетической гетерогенностью [8]. Изучены различные генетические повреждения в клетках опухоли, выявленные в генах белков, играющих ключевую роль в передаче внутриклеточных сигналов. Революционный прорыв в области персонализированной терапии был совершен в XXI веке и связан с открытием точечных мутаций в гене BRAF как причины более 80 % случаев развития меланомы. Ген BRAF кодирует внутриклеточные белки, участвующие в каскаде киназного сигнального пути, что в результате приводит к запуску неконтролируемой пролиферации клеток [1]. Было идентифицировано несколько мутаций, среди которых основная доля приходится на мутацию V600E (75 %) [9]. Для терапии меланомы, обусловленной мутацией V600E, были разработаны низкомолекулярные соединения-ингибиторы, которые способны селективно подавлять активность мутантного гена BRAF. Один из таких ингибиторов – Вемурафениб – уже в первом клиническом исследовании на пациентах с V600E-мутацией показал увеличение частоты объективных ответов (до 80 %) в сравнении со стандартной химиотерапией на основе Дакарбазина [10].

Несмотря на полученные обнадеживающие результаты, терапия на основе ингибиторов активности гена BRAF не позволяет добиться полной ремиссии первичной меланомы. Более того, у ряда пациентов с меланомой наблюдается прогрессирование опухолевого роста в течение 6–8 мес после проведенной терапии. Возникновение резистентности к проводимой терапии наблюдается в 44 % и может быть связано с отсутствием мутации V600E в гене BRAF части клеток меланомы у одного и того же больного [11].

Моноклональные антитела

Одной из наиболее успешных стратегий иммунотерапии является использование моноклональных антител (МКА). Привлекательность метода заключается в возможности получения специфичных МКА, обладающих высокой степенью активности, а также в простоте стандартизации таких препаратов. Успешное применение МКА стало возможным после замены Fc и Fv фрагментов мышиных антител человеческими с получением химерных и гуманизированных МКА [12–15].

Особое место среди препаратов на основе МКА занимают ингибиторы блокаторов иммунного ответа, создание которых стало настоящим прорывом в иммунотерапии. Ингибиторы блокаторов иммунного ответа селективно связываются с рецепторами PD-1 и CTLA-4 на поверхности иммунокомпетентных клеток. Молекула CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) экспрессируется на поверхности активированных Т-лимфоцитов, регулируя их активность на ранних стадиях иммунного ответа преимущественно в лимфоузлах. В свою очередь, молекула PD-1 (Programmed cell death 1) экспрессируется на поверхности Т-, В-лимфоцитов и натуральных киллерах (NK) и является негативным регулятором их функциональной активности на поздних стадиях иммунного ответа, главным образом в периферических тканях [16, 17]. Молекулы CTLA-4 и PD-1 негативно регулируют активацию пролиферации, внося определенный вклад в механизм ускользания опухоли из-под иммунологического надзора.

Не так давно для терапии меланомы управлением FDA были одобрены такие препараты МКА, как Ипилимумаб, Пидилизумаб, Пембролизумаб и Ни-волумаб, избирательно блокирующие рецепторы CTLA-4 и PD-1 на поверхности лимфоцитов [18, 19]. Результаты рандомизированных клинических исследований показали, что при лечении метастатической меланомы терапия на основе ипилиму-маба и ниволумаба превосходит по эффективности стандартную химиотерапию дакарбазином [20]. Помимо лечения меланомы Ниволумаб и Пембро-лизумаб применяются также в терапии рака легких и молочной железы, что дает основания говорить о наличии общих антигенов на поверхности опухолевых клеток и единых механизмов, вовлеченных в процесс развития опухолей различного генеза.

Подобно терапии на основе цитокинов, использование МКА связано с высоким риском развития побочных эффектов, степень выраженности которых определяется дозой препарата [21]. Наибольшего успеха в лечении метастатической меланомы удалось достичь при использовании комбинированных схем лечения с применением анти-PD-1 МКА и блокаторов мутантного гена BRAF, что, однако, не решает проблемы полного излечения больных. Кроме того, высокая стоимость препаратов этой генерации ограничивает их доступность.

Адаптивная клеточная иммунотерапия

Существенным препятствием, сдерживающим формирование стойкого иммунного ответа против клеток меланомы, является состояние иммуносупрессии опухолеспецифических клонов эффекторных Т-лимфоцитов в месте опухолевого микроокружения. В некоторой степени это можно преодолеть с помощью использования лимфоцитов, выделенных из опухолевого очага и активированных in vitro в среде с содержанием IL-2. Впервые положительный эффект от использования таких опухоль-инфильтрующих лимфоцитов был описан в 1994 г. В результате исследования, проведенного на 86 добровольцах, объективного ответа удалось достичь у 34 % больных меланомой [22, 23]. Введение таких опухолеспецифических лимфоцитов после химиотерапии или радиотерапии приводило к улучшению клинического исхода заболевания [24].

В лаборатории Эшхара (Израиль) разработали метод генетической модификации Т-клеточного рецептора лимфоцитов с использованием ленти-вирусных или ретровирусных векторов, которые позволяют добиться большей степени направленности и эффективности противоопухолевого иммунного ответа. С помощью такой технологии удается получить Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности химерный Т-клеточный рецептор (CAR/ Chimeric antigen receptor), специфически взаимодействующий с целевым антигеном [25].

Одним из примеров эффективного использования CAR лимфоцитов является терапия таких опухолей, как меланома и в 80 % случаев синовиальная саркома, клетки которых несут на своей поверхности раково-тестикулярный антиген NY-ESO. В результате исследований, проведенных у пациентов с меланомой и синовиальной саркомой, с использованием генетически измененных лимфоцитов был показан высокий уровень противоопухолевого иммунного ответа – у 55 % и 61 % больных соответственно. Серьезные побочные эффекты не наблюдались [26].

В то же время отмечается, что такие генетически измененные лимфоциты могут обладать аутоиммунной реактивностью по отношению к здоровым клеткам организма, содержащим на своей поверхности антигены, схожие с опухолевыми. Таким примером является получение CAR-лимфоцитов, распознающих антигены MART-1 или gp100 на поверхности клеток меланомы. При введении такие антиген-специфические реактивные клоны лимфоцитов обладали цитотоксическим потенциалом не только по отношению к клеткам меланомы, но и к нормальным меланоцитам кожи, глаз и других тканей организма. После проведенного курса терапии на основе CAR лимфоцитов наблюдались побочные эффекты в виде ухудшения зрения и слуха, витилиго, кожных проявлений [27].

Пептидные вакцины (ПВ)

В сравнении с другими вакцинами ПВ обладают рядом преимуществ, к которым относятся низкие экономические затраты, отсутствие специальных требований к условиям хранения, простота контроля качества и эффективности вакцины. Недостатком является тот факт, что такие вакцины в ряде случаев содержат узкий репертуар антигенов, результатом которого может быть недостаточная активация иммунной системы для развития стойкого противоопухолевого ответа. Кроме того, опухоль-ассоциированные антигены представлены и на нормальных клетках организма. Клоны реактивных Т-лимфоцитов, обладающих цитотоксическим потенциалом против антигенов собственных органов и тканей, были элиминированы иммунной системой в процессе негативной селекции в тимусе. Большинство пептидных вакцин включают антигены, которые представляются на поверхности антиген-представляющей клетки в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) аллельного варианта HLA-A0201, что может быть обусловлено частотой распространенности HLA-A0201 генотипа в человеческой популяции. Эффективная противоопухолевая вакцина должна включать наиболее иммуногенные эпитопы для активации репертуара функционально активных Т-лимфоцитов [28]. Одним из способов увеличения иммуногенности пептидных вакцин является введение в комплексе с адъювантами, что позволяет увеличить уровень противоопухолевого иммунного ответа [29–31].

Опухолеспецифические антигены клеток меланомы были описаны более двух десятков лет назад [32, 33]. Пептидные вакцины против меланомы чаще всего создаются на основе таких антигенов, как gp100, MAGE, Melan A (MART-1) и NY-ESO. Введение вакцины на основе синтетического пептида gp100 HLA-A2 позитивным больным с меланомой Ι–ΙΙΙ стадии привело к индукции специфического цитотоксического иммунного ответа с образованием пула Т-клеток памяти [34, 35]. Проведены исследования у больных МК ΙΙB–ΙV стадии после резекции опухоли, которым вводилась вакцина, включающая 12 пептидов из различных антигенов клеток меланомы. При этом наблюдалось увеличение уровня IFN-γ продуцирующих клеток в периферической крови и регионарных лимфоузлах [36].

В ΙΙΙ фазе клинических испытаний при введении пациентам с метастатической меланомой вакцины gp100 совместно с высокими дозами IL-2 удалось достичь увеличения уровня противоопухолевого иммунного ответа до 16 % против 6 % в группе, получавшей IL-2 в режиме монотерапии. Также наблюдалось увеличение периода безрецидивной выживаемости таких больных – 17,8 мес против 11,1 мес [37]. Более 20 клинических исследований доказали безопасность и хорошую переносимость пептидных вакцин [38].

Ганглиозидные вакцины

Многообещающим подходом для создания терапевтических противоопухолевых вакцин являются ганглиозидные вакцины. Ганглиозиды – это гликосфинголипиды, содержащие в своем составе одну или несколько молекул сиаловых кислот, экспрессируемых на поверхности всех клеток позвоночных. Ганглиозиды играют роль в межклеточных контактах, регулируют функцию таких сигнальных молекул, как рецептор эпидермального фактора роста и фактора роста эндотелия сосудов. Они являются высокогетерогенными структурами, отличающимися, в частности, разновидностью молекулы сиаловой кислоты, входящей в их состав. На поверхности мембраны опухолевых клеток и клеток эмбриональных тканей находятся в большей степени ганглиозиды, содержащие в составе молекулы N-гликолилнейраминовой кислоты. Такие ганглиозиды раковых клеток играют важную роль в опухолевой прогрессии, что делает их привлекательными в качестве мишени или основы для создания противоопухолевых вакцин.

Иммуногенность гликозидов опухолевых клеток обусловлена их способностью индуцировать образование специфических антител, увеличение уровня которых в сыворотке больного меланомой коррелирует с увеличением общей и безрецидив-ной выживаемости. Вакцина GM2-KLH/QS-21 на основе ганглиозида GM2 в течение 3 лет проходила клинические испытания в группах больных со ΙΙ стадией меланомы. Вакцина вводилась после хирургического иссечения опухоли и обладала способностью активировать гуморальный иммунный ответ. Дальнейшие исследования были приостановлены из-за неспособности вакцины улучшить клинический исход заболевания [39, 40]. Более значимого эффекта от использования ганглиозидных вакцин удалось достигнуть, применяя комбинированные схемы терапии. В результате проведенной ΙΙΙ фазы клинических испытаний сочетанного использования ганглиозидной вакцины NeuGcGM3/VSSP и препарата Ракотумомаб на основе МКА была показана эффективность и хорошая переносимость выбранной схемы терапии в группах пациентов с метастатической меланомой [41] и немелкоклеточным раком легкого [42].

Клеточные вакцины

Проведенные ранее исследования показали, что вакцины на основе опухолевых клеток могут индуцировать развитие стойкого иммунного ответа. Такие вакцины могут создаваться на основе как целых опухолевых клеток, так и опухолевого лизата. В зависимости от источника опухолевых клеток такие вакцины делятся на аллогенные и аутологичные. Аутологичные вакцины готовятся на основе собственных опухолевых клеток пациента, и в комплексе с адъювантами (IL-2; GM-CSF, БЦЖ) вводятся в организм больного. Такие вакцины были исследованы в ряде клинических испытаний для различных видов онкологических заболеваний [28]. Аутологичные опухолевые вакцины содержат широкий спектр опухолевых антигенов клеток меланомы с HLA-генотипом самого больного. Аутологичные клеточные вакцины фактически являются персонализированными. Сложности, связанные с отсутствием возможности получения достаточного количества опухолевого материала у некоторых больных, ограничивают применение таких вакцин в широком масштабе. На поздних стадиях заболевания, при наличии отдаленных метастазов, эффективность аутологичных вакцин снижается из-за генетической и фенотипической гетерогенности клеток меланомы первичного очага и метастазов [43].

Вакцина FANG, состоящая из аутологичных опухолевых клеток меланомы, трансфицированных плазмидой, кодирующей ген GM-CSF, показала способность индуцировать противоопухолевый иммунный ответ, который коррелировал с увеличением продолжительности жизни больных меланомой [44]. Аутологичная вакцина M-VAX на основе аутологичных модифицированных клеток меланомы с использованием гаптенов показала эффективность в исследованиях при введении больным с метастатической меланомой в сочетании с адъювантом (бациллой Калметта – Герена) [45].

Аллогенные вакцины чаще состоят из клеток нескольких меланомных линий (поливалентные) и отличаются менее трудоемкой технологией производства в отличие от аутологичных опухолевых вакцин [46]. Вакцина GVAX, состоящая из летально облученных аллогенных клеток меланомы, секретирующих GM-CSF, исследовалась в Ι фазе клинических испытаний. Полученные результаты показали безопасность применения такой вакцины. Введение вакцины способствовало увеличению уровня сывороточного GM-CSF. Также наблюдалось увеличение уровня циркулирующих моноцитов в крови больных с одновременным снижением среди них доли супрессорных миелоидных клеток [47]. Другая аллогенная клеточная вакцина Canvaxin, состоящая из 3 облученных клеточных линий меланомы, показала свою эффективность во ΙΙ фазе клинических исследований. При этом в ΙΙΙ фазе она не показала видимого клинического эффекта. Введение вакцины совместно с адъювантом позволяет увеличить её иммуногенный потенциал. Существенное влияние на уровень индуцируемого вакциной иммунного ответа также оказывают доза, частота и способ введения препарата [28].

ДНК-вакцины

Среди современных направлений создания терапевтических вакцин против меланомы привлекательным является подход на основе полиэпи-топных иммуногенов. Иммунотерапия на основе ДНК-вакцин, кодирующих множественные эпито- пы из различных опухолевых антигенов, является простым, безопасным и эффективным методом индукции высокого уровня Т-клеточного иммунного ответа против клеток опухоли. ДНК-вакцины, кодирующие гены цитокинов или опухолевых антигенов, способны усиливать или индуцировать de novo развитие Т-клеточного иммунного ответа против основных опухолевых антигенов, играющих ключевую роль в возникновении, прогрессии и метастазировании опухоли [48–50]. Преимуществом ДНК-вакцин, кодирующих Т- и В-клеточные эпитопы опухолевых антигенов, является способность активировать эффекторное звено как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Кроме того, производство ДНК-вакцин не требует больших финансовых затрат. Часть ДНК-вакцин против инфекционных (СПИД, гепатит B, герпес, малярия, Эбола, грипп) и онкологических заболеваний (лимфома, меланома, саркома, рак молочной железы, рак шейки матки, рак простаты, рак яичников) была исследована на разных этапах клинических испытаний [51, 52].

В ветеринарии получили лицензию 3 вакцины, одна из которых предназначена для терапии меланомы у собак. Вакцина представлена молекулой ДНК, кодирующей человеческий ген тирозиназы, показавшая безопасность и эффективность при лечении оральной меланомы у собак [53].

В результате I фазы рандомизированных клинических испытаний ДНК-вакцина против меланомы, кодирующая полноразмерный белок gp100, продемонстрировала свою безопасность и способность индукции эффекторных Т-лимфоцитов после введения больным меланомой. Наблюдались локальные реакции в месте введения вакцины в отсутствие серьезных побочных эффектов [54]. Другим примером ДНК-вакцины против меланомы является вакцина на основе молекулы ДНК, кодирующей ген тирозиназы. Вакцина вводилась добровольцам с меланомой III–IV стадии. Специфический Т-клеточный ответ развивался у 7 из 18 больных [55].

Для эффективной активации эффекторных Т-лимфоцитов, как ключевого звена противоопухолевого иммунного ответа, ДНК-вакцина должна содержать широкий набор антигенных детерминант из различных опухолевых белков. Такая вакцина способна индуцировать стойкий иммунный ответ на различные опухолевые антигены. Использование ДНК-вакцины, содержащей наиболее иммуногенные эпитопы из 5 меланомных антигенов, приводило к индукции специфического Т-клеточного иммунного ответа [56].

Вакцина Talimogene Laherparepvec (T-VEC) на основе генетически модифированного вируса простого герпеса (HSV-1) успешно прошла III фазу рандомизированных исследований и в 2015 г. была одобрена FDA для лечения метастатической меланомы. Такой вирус инфицирует как здоровые, так и опухолевые клетки, но реплицируется только в клетках опухоли, индуцируя системный противоопухолевый иммунный ответ. Очевидно, что основой при создании ДНК-вакцин является выбор наиболее иммуногенных эпитопов, а также поиск эффективных способов доставки вакцины. Такой подход позволяет повысить противоопухолевый потенциал ДНК-вакцин за счет преодоления иммунологической толерантности, активируя специфический Т-клеточный иммунный ответ [57].

Вакцины на основе дендритных клеток

Уникальные свойства дендритных клеток (ДК) побудили ученых всего мира к созданию вакцин на их основе. Конечной целью такого подхода является индукция опухолеспецифического Т-клеточного иммунного ответа с использованием дендритных клеток, нагруженных опухолевыми антигенами. Дендритные вакцины являются высокоиммуногенными и безопасными [58]. Зрелые дендритные клетки получают несколькими способами: из моноцитов периферической крови, CD34+ предшественников, а также выделением ДК непосредственно из периферической крови с использованием магнитной сепарации [59, 60]. Во многих лабораториях используют миелоидные ДК, полученные из моноцитов [61–64].

На сегодняшний день Агентство Министерства здравоохранения и социальных служб США (FDA, USFDA) подтвердило эффективность и безопасность использования вакцины Sipuleucel-T ({Kantoff, 2010 #128}Provenge®) для терапии рака простаты. Вакцина Sipuleucel-T в III фазе клинических испытаний показала высокую эффективность и увеличение выживаемости против контрольной группы пациентов [65].

Побочные эффекты от использования дендритных вакцин ограничиваются главным образом гриппоподобными симптомами и локальными реакциями в месте введения вакцины [66]. В результате I фазы клинических испытаний вакцина DC/Apo-Nec, состоящая из аутологичных дендритных клеток, нагруженных аллогенными опухолевыми клетками в состоянии некроза/апоптоза, показала безопасность и хорошую переносимость у всех добровольцев (NCT00515983). Кроме того, вакцина DC/Apo-Nec обладала противоопухолевым потенциалом [67]. Другим примером является вакцина на основе аутологичных ДК, нагруженных белком gp100 и тирозиназой. Вакцина вводилась 14 больным с метастатической увеальной меланомой (NCT00243529). У 29 % больных, получавших вакцину, был индуцирован специфический иммунный ответ в отсутствие выраженной токсичности [68].

Впервые противоопухолевый потенциал был исследован у вакцины на основе плазмоцитоидных ДК, полученных из CD34+ предшественников и нагруженных опухолеассоциированными пептидами ex vivo. Проведена I фаза клинических исследований на 15 больных метастатической меланомой, которым дендритная вакцина вводилась в лимфоузлы. Результаты исследования показали увеличение уровня сывороточного IFN-γ после введения вакцины (NCT01690377) [69].

Эффективность терапии на основе ДК обусловлена их способностью активировать не только цитотоксические Т-лимфоциты, но и NK-клетки для борьбы с опухолью. Увеличение активности NK-клеток наблюдалось в 50 % случаев после вакцинации с использованием зрелых ДК. NK-клетки могут бороться с опухолью как прямым воздействием на раковые клетки, так и опосредованно, поддерживая активность цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов [70]. Существующий скептицизм в среде ученых в отношении использования ДК в режиме монотерапии обусловлен низкой частотой клинически значимых эффектов, полученных при исследовании ряда вакцин. Тем не менее с каждым годом идея использования ДК в терапии онкологических заболеваний становится более реальной. Изменяя условия созревания и активации ДК, подбирая оптимальный набор опухолевых антигенов для их активации, удается получать ДК с более высоким противоопухолевым потенциалом. Использование дендритных вакцин в качестве адъювантов позволяет существенно увеличить уровень иммунного ответа, приводя к увеличению продолжительности жизни и улучшению её качества у онкологических больных [71, 72].

Заключение

По мере роста знаний о молекулярных основах взаимодействия опухоли и иммунной системы человека увеличивается интерес к иммунотерапии,