Индикаторные микроорганизмы - контаминанты кишечного микробиома щенков бельгийской овчарки (малинуа)

Экологическая система «макроорганизм» ‒ «микроорганизм» весьма сложна и взаимодействия в ней определяются многочисленными факторами. В условиях вольерного содержания служебных животных, в кинологических городках особенно выражено формирование общего микро-боценоза в период взросления щенков, т. к. щенки одного помета занимают одну территорию. Интен сивность воздействия микр обиологических факто-

ров может превышать компенсаторные возможности экологической системы «организм хозяина – его микрофлора», поэтому одним из проявлений нарушения этого баланса является кишечный дисбактериоз. В настоящее время существует несколько определений понятия «дисбактериоз кишечника» [Красноголовец, 1989; Гребнев, Мягкова, 1994; Николаева, 2002]. На основании Приказа Минздрава РФ от 9 июня 2003 г. № 231 Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. дисбактериоз кишечника» под дисбакте- риозом кишечника понимают клинико-лабораторный синдром, связанный с изменением качественного и/или количественного состава микрофлоры кишечника с последующим развитием метаболических и иммунологических нарушений с возможным развитием желудочно-кишечных расстройств.

Обзор литературных данных показывает, что микробоценоз кишечника оказывает большое влияние на функциональное состояние организма животного [Алешукина, 2003; Физиологические ..., 2008; Кормление …, 2010; Колычев, Госманов, 2014; Шалабот и др., 2014; Крылова, 2015]. Сообщество микрофлоры всего макроорганизма принято называть микробиотой или микробиомом и рассматривать как одну из функциональных систем макроорганизма, не имеющую жесткой анатомической структуры (как, например, иммунная система) [Шубкина, 2018]. Вместе с тем, недостаточно сведений о критериях оценки состояния микробиома кишечника, сроках его становления и особенностях воздействия на функциональное состояние животных; сообщения на эту тему касаются в основном продуктивных животных и направлены на лечебные мероприятия. В связи с вышесказанным, целью исследования явилось проведение комплексного анализа кишечного микробоценоза с оценкой его функционального состояния у щенков служебных собак породы бельгийская овчарка (малинуа).

Материал и методы исследования

Материал

Исследование и отбор проб для микробиологического анализа проводились на учебном комплексе кинологического факультета Пермского военного института войск национальной гвардии Российской Федерации (далее – УК Ф(К) ПВИ ВНГ РФ). Для достижения цели исследования были проанализированы полученные экспериментальные данные по анализируемой выборке: щенки помета «Р1» (11 голов): Раф, Райс, Ракс, Руф, Рапир, Риска, Регги, Рика, Руби, Рута, Рэми. Дата рождения – 12.04.2019 г.

В период динамического наблюдения кормление щенков являлось натуральным и осуществлялось согласно рационам кормления [Об утверждении …]. В качестве витаминно-минеральной подкормки применялся препарат «Полидекс Гелабон», рекомендованный к применению щенкам до полного формирования костной и хрящевой ткани.

Методы исследования

Исследование на дисбактериоз кишечника проводили согласно методическим рекомендациям [Методы …, 1991]. Отобранный 1 г исследуемого материала (фекалий) помещали в пробирку с фи- зиологическим раствором. После эмульгирования стеклянной палочкой взвеси давали отстояться при комнатной температуре 10‒15 мин. и 0.1 мл переносили в следующую пробирку с 9.9 мл физиологического раствора (10-1). Из основного разведения (10-1) производили посев на плотные питательные среды (Плоскирева, Левина) для выделения патогенных микроорганизмов. Далее, из разведения 103 отбирали по 0.1 мл на поверхность среды Сабуро и желточно-солевого агара (ЖСА). Из разведения 10-5 производили посевы на чашки со средой Эндо по 0.1 мл. Для выделения анаэробных бифидо- и лактобактерий производили высев из разведений 10-7, 10-9 в 2 пробирки (по 0.1 и 1 мл) регенерированной в течение 1 ч. среды Блаурокка, Бликфельдта либо МРС. Среды для выращивания аэробов помещали в термостат при 37°С (Сабуро – при 20°) на 18‒24 ч. Рост анаэробов учитывали через 48‒72 ч. Определяли количество кишечной палочки и других микробов в 1 г фекалий по числу колоний, выросших на соответствующей питательной среде с пересчетом на количество посеянного материала и степени его разведения.

Микроскопическое исследование фекалий животного, химический анализ проводили согласно общепринятым методам [Костенко, Скаршевская, Гительсон, 1989]. Дополнительно использовали методики приготовления препаратов для дифференциации растительной клетчатки, мышечных волокон, нейтрального жира, жирных кислот, лейкоцитов, эритроцитов, кишечного эпителия, слизи. Произвольное количество фекалий щенков анализируемого поголовья растирали с раствором Люго-ля. По окрашиванию обнаруживали крахмал, йо-дофильную микрофлору.

Диагностику на наличие в фекалиях яиц гельминтов проводили согласно рекомендациям [Инструкция мероприятий …, 1999] методом нативного мазка путем прямого подсчета в поле зрения с использованием микроскопа. Часть анализов на выделение и идентификацию бактерий желудочнокишечного тракта проводилась в испытательной лаборатории ГБУВК «Пермский ветеринарный диагностический центр». Результаты микробиологических исследований получены в виде протокола: № 04-2512 от 16 июля 2019 г.

Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

Динамическое наблюдение за функциональным состоянием кишечного микробиома проведено в два этапа: в возрасте щенков 3 и 5.5 месяцев.

Выделение нормальной микрофлоры для оценки функционального состояния кишечника щенков производилось из восьмого опытного разведения.

Анализ выявил, что биоразнообразие микроорганизмов данной группы представлено споровыми анаэробами, бактериями рода Bifidobacterium и рода Lactobacillus.

Анализ экспериментальных данных (табл. 1) показал, что на первом этапе исследования доля естественной микробиоты у щенков помета «Р1»

составила 66.7%. Известно, что нормальная микрофлора кишечника является первичной мишенью для любого попадающего с пищей или водой соединения, первым метаболическим органом, который вовлекается в процессы детоксикации потенциально вредных агентов.

Таблица 1

Качественный и количественный анализ микробиоты кишечника щенков бельгийской овчарки помета «Р1», возраст 3 месяца

Микрофлора, разведение	Группа или род/ вид бактерий	Проба, номер
		1	2
		КОЕ*/г
Нормальная, Х 10 -8	Споровые анаэробы	рост	рост
	Род Lactobacillus	рост	рост
	Род Bifidobacillus	рост	рост
Условно-патогенная, Х 10 —4	Род Staphylococcus	0	0
	Род Enterococcus: E. faecium E. faecalis	10 0	0 0
	Род Streptococcus	0	0
Условно-патогенная, Х 10 -5	Род Proteus: P. mirabilis P. vulceris	0 0	0 0
	Род Klebsiella: K. pneumonia	0	0
	Род Citrobacter: C. freundii C. disersus	0 0	0 0
Патогенная, х 10 -1	Род Salmonella	0	0
	Род Escherichia: E. coli	2	6
	Энтеро-патогенная	0	0
	Токсикогенные клостридии	0	0

Примечание. *КОЕ – здесь и далее – колониеобразующая единица; «рост» ‒ рост бактерий в жидкой питательной среде не менее, чем в восьмом разведении.

Условно-патогенная микробиота представлена грамположительными бактериями семейства Enterococcaceae: E. faecium, E. faecalis [СП 1.3.3118-13], Наличие бактерий E. faecium отмечено в 50% смешанных проб фекалий щенков помета «Р1». Бактерии родов Streptococcus , Staphylococcus , Proteus , Klebsiella , Citrobacter – изолированы не были, все пробы оказались отрицательными. Доля условно-патогенных микроорганизмов, представленных энтеробактериями, составила 8.3%.

Патогенные бактерии составили 25% всей совокупности. Контаминация кишечной палочкой отмечена во всех отобранных пробах фекалий. Несмотря на то, что бактерии данного вида являются условно-патогенными микроорганизмами, при проведении эксперимента они были изолированы из разведения, констатирующего факт патогенного количества.

По мере взросления щенков, на втором этапе исследования, динамика изменений коснулась всех групп кишечной микрофлоры щенков бельгийской овчарки помета «Р1» (табл. 2). Естественная микрофлора, присутствующая в норме, была представлена споровыми анаэробами (50% проб), бифидобактериями рода Bifidobacterium (66.6% проб) и лактобактериями рода Lactobacillus (66,6% проб).

Анализ экспериментальных данных (табл. 2) выявил, что на втором этапе исследования доля микробоценоза, обусловливающего колонизационную резистентность кишечника, составила 45.5%. Отмечен дисбиоз по лактобактериям в пробах № 65 (Райс, Рэми), 69 (Руби); по бифидобактериям в пробах № 67 (Руф, Риска), 68 (Рапир, Рика). Данные свидетельствуют уже на этом этапе о первой степени дисбиоза кишечника щенков.

Известно, что дисбактериоз – нарушение нор-мофлоры кишечника, на первый взгляд, кажущееся незначительным ‒ может стать базой опасных дисфункций [Болотовский, 2003]. Бактерии, осуществляющие бифидоброжение, играют большую роль в функционировании желудочно-кишечного тракта человека и животных. Благодаря их жизнедеятельности снижается способность к размноже- нию патогенных и условно-патогенных бактерий (эшерихии, клебсиеллы, сальмонеллы, протей, ши-геллы, стрепто- и стафилококки, вибрионы, кам-пилобактерии, клостридии и др.), нормализуется микробиоценоз в целом. Симбиоз с микроорга- низмами пристеночного пищеварения обеспечивает организм животного важными витаминами и биологически активными компонентами [Ильин, Воложин, Виха, 2005; Кормление …, 2010].

Таблица 2

Качественный и количественный анализ микробиоты кишечника щенков помета «Р1», возраст 5.5 месяцев

Микрофлора, разведение	Группа или род/ вид микроорганизмов	Проба, кличка собаки
		64 (Рута, Регги)	65 (Райс, Рэми)	66 (Ракс, Раф)	67 (Руф, Риска)	68 (Рапир, Рика)	69 (Руби)
		КОЕ
Нормальная, Х 10 -8	Споровые анаэробы	0	рост	рост	0	рост	0
	Род Lactobacillus	рост	0	рост	рост	рост	0
	Род Bifidobacillus	рост	рост	рост	0	0	рост
Условнопатогенная, Х 10 —4	Род Staphylococcus	3	8	3	6	7	7
	Род Enterococcus: E. faecium E. faecalis	0 0	0 0	рост 0	0 0	6 0	0 0
	Род Streptococcus	0	0	0	0	0	0
Условнопатогенная, Х 10-5	Род Proteus: P. mirabilis P. vulceris	0	0	0	0	0	0
	Род Klebsiella: K. pneumonia	0	10	5	0	0	23
	Род Citrobacter: C. freundii C. disersus	0	0	0	0	0	0
Условнопатогенная, Х 10 —3	Плесневые микро-мицеты	0	1	1	0	0	0
	дрожжи	0	0	0	56	1	6
Патогенная, Х 10-1	Род Salmonella	0	0	0	0	0	0
	Род Escherichia: E. coli	38	22	+++ более 120	более 20	8	8
	Энтеро-патогенная	0	0	0	0	0	0
	Токсикогенные клостридии	0	0	0	0	0	0
	Род Staphylococcus	84	15	78	53	45	14

Примечание. * КОЕ - колониеобразующая единица; «рост» ‒ рост бактерий в жидкой питательной среде не ме- нее чем в восьмом разведении.

Лактобактерии осуществляют собственно молочнокислое брожение, принимают участие в обмене углеводов, белков, липидов, нуклеиновых кислот. Установлена важная роль лактобактерий в становлении иммунитета у новорожденных щенков, в стимулировании продукции иммунорегуляторов - интерферонов и интерлейкинов [Кормление …, 2010; Садыкова, 2014].

Условно-патогенные микроорганизмы в отобранных пробах были представлены бактериями семейств Enterococcaceae и Staphylococcaceae – в 33.3% и 100% проб соответственно; семейства Enterobacteriaceae – в 50% проб; плесневые мик-ромицеты выявлены в 33.3% проб; дрожжеподобные микромицеты изолированы из 50% проб. Доля условно-патогенных микроорганизмов в целом составила 24.8%.

Патогенные микроорганизмы представлены группами:

• 1)    грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae – 100% проб;

• 2)    грамположительных бактерий семейства Staphylococcaceae – 100% проб.

Доля патогенных микроорганизмов составила 29.7%. Известно, что ассоциации условнопатогенных микроорганизмов регистрируются при третьей степени дисбактериоза [ОСТ 91500.11.0004-2003].

Для макроскопического анализа были отобраны смешанные пробы кала щенков помета «Р1» в возрасте 5.5 мес.

Количество фекалий, выделяемое за одну дефекацию и за сутки у щенков, находящихся на натуральном кормлении, являлось удовлетвори- тельным.

Консистенция и форма фекалий зависит прежде всего от содержания воды в кале. Анализ экспериментальных данных показал, что кал у 83.3% особей имел полужидкую, кашицеобразную консистенцию. Такая картина может наблюдаться при употреблении большого количества растительной пищи, усиливающей перистальтику кишечника, при однообразном монорационе. 16.7% проб кала отмечены как «водянистый», «жидкий» ‒ с большим содержанием воды (более 80‒85%).

Цвет фекалий основной выборки характеризовался как зеленовато-коричневый, одна проба (№69, Руби) – светло-оранжевый – указывающий на то, что пища прошла через желудочнокишечный тракт слишком быстро. Это подтверждает анализ росто-весовых характеристик данной особи – интенсивность прироста веса недостаточная по сравнению с выборкой в целом, а это свидетельствует о том, что функциональные характеристики состояния кишечника и переваривания пищи – неудовлетворительные.

Запах фекалий основной выборки – нерезкий, специфический. Неприятный, гнилостный запах, был отмечен у проб 65 (Райс, Рэми), 68 (Рапир, Рика), 69 (Руби), т.е. у 50% анализируемой выборки. Неприятный запах кала обусловлен присутствием в нем некоторых веществ (индола, скатола, фенола, крезолов и др.), образующихся в результате бактериального распада белков. В период исследования, длительное время, в рационе щенков присутствовала курица.

Наличие примеси . Макроскопический анализ анализируемых проб позволил дифференцировать:

• -    растительную клетчатку (80% проб);

• -    мышечные волокна (50% проб), свидетельствующие о недостаточности желудочного или панкреатического переваривания;

• -    нейтральный жир, жирные кислоты, мыла, лейкоциты, эритроциты – отсутствовали;

• -    слизь – в небольшом количестве, в виде малозаметного блестящего налета была выявлена во всех пробах (100% проб);

• -    яйца гельминтов (100% проб: 17, 88, 30, 7, 76, 23 яйца в поле зрения);

• -    пробы 65 (Райс, Рэми) и 69 (Руби) выявили реакцию на крахмал и йодофильную микрофлору. Крахмал приобрел фиолетовый цвет, в виде зерен. При нормальном пищеварении крахмал отсутствует, присутствие его указывает на недостаточность пищеварения, что бывает при заболеваниях тонких кишок и связанной с ними ускоренной эвакуации, при недостаточной секреции поджелудочной железы;

• -    пробы 64 (Рута, Регги), 65 (Райс, Рэми), 67 (Руф, Риска), 68 (Рапир, Рика) имеют слабощелочную и щелочную реакцию, что свидетельствует об

активизации гнилостной микрофлоры с образованием аммиака.

Таким образом, оба этапа исследования микробиома кишечника щенков выявили дисбаланс в функциональном состоянии желудочно-кишечного тракта:

• 1.    У 50% анализируемой выборки особей (Райс, Рэми, Рапир, Рика, Руби) запах отделяемого нижнего отдела кишечника характеризовался как неприятный, зловонный, по консистенции – водянистый жидкий (Руби), кашицеобразный водянистый (Рапир, Рика).

• 2.    У трех особей (Райс, Рэми, Руби) выявлено наличие крахмала и йодофильной микрофлоры, свидетельствующее о недостаточном переваривании пищи.

• 3.    У восьми щенков (Рута, Регги, Райс, Рэми, Руф, Риска, Рапир, Рика) величина рН показала слабощелочную и щелочную реакцию среды, что свидетельствует о наличии гнилостной микрофлоры.

• 4.    Патогенная микрофлора выявлена во всех пробах фекалий от данного помета – как на первом, так и на втором этапах исследования. Присутствие естественной микробиоты на первом этапе исследования сменилось недостатком нормальной микрофлоры в возрасте щенков 5.5 месяцев. Три особи (Райс, Рэми, Руби) имели дисбиоз по лактобактериям. Четыре особи (Руф, Риска, Рапир, Рика) характеризовались отсутствием бифидобактерий. Ситуация усугубилась наличием условнопатогенной микофлоры: Пробы четырех особей (Райс, Рэми, Ракс, Раф) контаминированы жизнеспособными спорами плесневых микромицетов, пробы пяти особей (Руф, Риска, Рапир, Рика, Руби) имели обсеменение микроскопическими дрожжами. Большое количество йодофильной флоры обнаруживают при недостаточном усвоении углеводов, усиленных процессах брожения в кишечнике. Значительное количество дрожжевых клеток находят при кандидомикозе и дисбактериозе. Экспериментальные данные свидетельствуют о первой и второй степени дисбактериоза у анализируемого поголовья.

• 5.    Кишечный дисбиоз выявлен на фоне глистной инвазии Toxocara canis у щенков помета «Р1»: в 7.6 раза увеличилась контаминация яйцами глистов в поле зрения в течение анализируемого периода. Установлено, что при гельминтозах в желудочно-кишечном тракте животных интенсивно развивается факультативная микрофлора, ее патогенность резко повышается, а облигатная микрофлора угнетается [Никитина, 2002]. В свою очередь, антигельминтики, систематически применяемые у собак с профилактической целью, также понижают естественную резистентность и оказывают отрицательное воздействие на микрофлору

  [Кузьмин, 2004]. На УК Ф(К) ПВИ ВНГ РФ уже с 21-го дня жизни щенков используются антигельминтные препараты. Для анализируемой выборки щенков применялся препарат «Тронцил», рекомендуемый согласно Инструкции по применению препарата, с 6-недельного возраста (табл. 3).

• 6.    Соотношение: нормальная микрофлора: условно-патогенная микрофлора: патогенная микрофлора у щенков помета «Р1», на первом этапе исследования имело следующий вид:

• 66.7 % : 8.3% : 25.0%

• 45.5 % : 24.8% : 29.7%

Таблица 3 Проведение мероприятий по дегельминтизации собак служебных пород на УК Ф(К) ПВИ ВНГ РФ

Возраст	Предпрививочный дегельминтик
21 день (перед I иммунизацией)	«Тронцил» Разрешен с 6 недель
7 недель (перед II иммунизацией)	«Тронцил»
11 недель (перед III иммунизацией)	«Тронцил»
Взрослые собаки	Профилактика 1 раз в квартал

‒ первая степень дисбиоза, компенсированная.

На втором этапе:

‒ вторая степень дисбиоза, компенсированная.

Заключение

В поддержании динамического равновесия равнозначно участвуют макроорганизм и микроорганизмы. Причины, вызывающие дисбаланс у человека и животного, могут быть эндогенного и экзогенного происхождения. В.К. Ильин, А.И. Воло-жин, Г.В. Виха [2005] указывают на следующие факторы, нарушающие эубиоз:

• -    микроэкологические : применение антибиотиков, гормонов; хирургические операции на органах ЖКТ, острые кишечные инфекции, хронические заболевания ЖКТ;

• -    макроэкологические : изменение среды обитания, длительное воздействие неблагоприятных экологических факторов, нервно-психический стресс; голодание, нерациональное питание, ави-томиноз.

К проблеме профилактики и лечения дисбактериозных состояний необходимо применять комплексный подход. Восстановление состава и функциональной активности нормальной микрофлоры щенков в кинологических подразделениях может состоять из ряда последовательных этапов:

кормление различными видами корма.

Зная основные закономерности и значение формирования неспецифической резистентности организма собак, специалист-кинолог может разрабатывать и осуществлять мероприятия по профилактике заболеваний; поддержанию естественной защиты организма через подбор правильного рациона питания; использование биологически активных добавок, витаминов, пробиотиков, что позволит блокировать инфекционный процесс на ранних стадиях развития и способствовать сбережению здоровья служебных собак.