Индивидуальный прогностический алгоритм риска прогрессирования рака пищевода после хирургического лечения

В связи с тяжелым течением плоскоклеточного рака пищевода (РП), его склонностью к быстрому прогрессированию после хирургического лечения и слабой чувствительностью к химиолучевой терапии проблема индивидуального прогнозирования течения РП с использованием различных клинических и лабораторных критериев является актуальной. Если среди клинических параметров прогностическое значение имеет, прежде всего, распространенность процесса, в частности вовлечение в него лимфоузлов, то из лабораторных даже такие очевидные характеристики, как пролиферативная активность опухоли, не всегда находят подтверждение, а некоторые из иммуногистохимических показателей опухоли получают в литературе противоположные трактовки [1, 2]. Прогноз онкологических заболеваний, как и возможность применения иммунотерапии в комплексном лечении, во многом зависит от состояния локального иммунитета [3, 4]. Значение присутствия клеток иммунной системы в микроокружении опухоли при клинически манифестированных онкологических заболеваниях может быть двояким в свете представлений об иммуноредактировании опухо- ли, согласно которым лимфоциты могут проявлять иммуносупрессивное или ростостимулирующее действие [5, 6].

Немногочисленность и неполнота данных литературы об иммунологическом микроокружении РП побуждают к дальнейшим исследованиям в этой области. Ранее отмеченная негативная роль высоких концентраций IL-6 в крови больных РП позволяет рассматривать этот показатель в качестве онкомаркера, имеющего преимущество перед антигеном плоскоклеточного рака (SCCA) и раковоэмбриональным антигеном (CEA) [7, 8].

При ИГХ-исследовании состава внутриопу-холевых лимфоцитов U. Zingg et al. [7] не обнаружили различий по содержанию CD3+, CD8+ и FoxP3+ при различном клиническом течении РП. Напротив, нами было показано прогностическое значение соотношения уровней T-reg клеток (CD3+CD25+CD127dim) и CD8+ Т-лимфоцитов в ткани линии резекции и опухоли, причем повышение первого наблюдалось у больных с коротким, а повышение второго – с длительным периодом до прогрессирования у больных РП [9]. В настоящее время математическое моделирование различных медико-биологических процессов, в том числе и

Таблица 1/table 1

Возраст/Age		Пол/Gender		Стадия/Stage			G
Мин/	Макс/	Муж/	Жен/	I	II	III	1	2	3
Min	Max	Male	Female
33	76	28	12	10	15	15	5	20	15
		(70 %)	(30 %)	(25 %)	(37,5 %)	(37,5 %)	(12,5 %)	(50 %)	(37,5 %)

Распределение больных РП (n=40) по клиническим характеристикам distribution of patients with esophageal cancer by clinical characteristics

риска прогрессирования злокачественных опухолей, привлекает внимание исследователей, однако в литературе мы не встретили подобного подхода к прогнозированию РП.

Целью исследования явилась разработка прогностического алгоритма оценки риска прогрессирования плоскоклеточного рака пищевода на основании изучения показателей его лимфоцитарного микроокружения.

Материал и методы

В работу включены данные, полученные в ходе клинико-лабораторного исследования 40 больных раком пищевода (табл. 1), которые получали хирургическое лечение в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте. Всем больным была выполнена операция Льюиса, дополненная стандартной двухзональной лимфодиссекцией. Специальной (системной и локальной) противоопухолевой терапии не проводилось. Больных наблюдали в течение 3 лет после операции, отмечали время развития прогрессирования заболевания.

При проведении операции брали образцы ткани опухоли размером 0,5×1,0 см, гомогенизировали с помощью Medimachine 30–60 сек. Полученные гомогенаты центрифугировали 4 мин при 1500 об/ мин. В осадке определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов на проточном цитометре FACSCantoII (BD): T(CD3+, CD3+СD4+, CD3+CD8+), B(CD19+), NK (CD16+CD56+), Т-регуляторные (Treg, CD4+CD25+CD127dim) клетки с соответствующими панелями антител. Результаты определения T, B, NK-клеток выражали в процентах от общего количества лимфоцитов, T regs – в процентах от CD3+CD4+ клеток.

Для статистической обработки полученных данных использовали программу Statistica 12.0 (StatSoft, США). Прогностический алгоритм расчета риска прогрессирования РП был разработан методом дискриминантного анализа с определением линейных уравнений функций классификации после создания матрицы факторной структуры [10]. Для оценки результатов хирургического лечения РП в течение 3 лет после операции использовались разработанные нами уравнения трех функций – F0, F6–12, F12–24, при этом F0 соответствует заключению об отсутствии риска прогрессирования в течение 3 лет; F6–12 – заключению о высоком риске прогрессирования заболевания в течение 6–12 мес; F12–24 – заключению о высоком риске прогрессирования заболевания в течение 12–24 мес после операции.

Результаты и обсуждение

На первом этапе путем пошагового включения различных показателей в модель были выбраны два параметра с наибольшей и статистически значимой дискриминантной мощностью. Ими оказались процентное содержание CD3+CD4+ и T-reg в ткани опухоли; дискриминантная мощность остальных исследованных показателей не была статистической значимой.

При разделении больных РП в зависимости от сроков прогнозируемого прогрессирования заболевания были рассчитаны коэффициенты и определены математические выражения для трех дискриминантных функций (F0, F6–12, F12–24), организованные в модель. Все показатели, включенные в модель, имели высокое значение F-статистики (F-remove). Соответствующий каждому показателю F-статистики уровень значимости р имел высокую доверительную значимость (p<0,05) (табл. 2).

При использовании модели для определения сроков прогрессирования индивидуальные значения иммунологических показателей больного вносили в каждое из трех уравнений для функций F0, F6–12, F12–24 и рассчитывали 3 значения F:

• ^– F₀=0^–,39×Х1+0,0095×Х2-9,86;

F6–12=0,24×Х1+0,12×Х2-6,7;

F12–24=0,39×Х1+0,066×Х2-11,57, где Х1 – %– CD3+CD4+, Х2 – % T-reg.

В общем для модели значение F-статистики составило 3,88, статистическая значимость была высокой (p=0,034).

Таблица 2/table 2

Параметры дискриминантной мощности показателей клеточного иммунитета, включенных в модель the parameters of the discriminant power of cellular immunity indices included in the model

Показатели/ Parameters	F-remove	p
CD3+CD4+	5,397402	0,012
T-reg	3,811463	0,048

Таблица 3/table 3

Автоматизированный расчет значений трех дискриминантных функций у больного П. automated calculation of the values of three discriminant functions in patient p.

Показатели/ Parameters	Индивидуальное значение/ Individual value	Коэффициенты/Coefficients			Функции/Functions
		Прогрессирования нет в течение 3 лет/ No progression for 3 years	Прогрессирования нет 6–12 мес/ No progression for 6–12 months	Прогрессирования нет 12–24 мес/ No progression for 12–24 months	F 0	F6–12	F 12–24
CD3+CD4+	23,5	0,39	0,24	0,39	9,17	5,64	9,17
T-reg	24,6	0,0095	0,12	0,066	0,23	2,95	1,62
Constant		-9,86	-6,70	-11,57	-9,86	-6,70	-11,57
					-0,46	1,89	-0,78

Таблица 4/table 4

Автоматизированный расчет значений трех дискриминантных функций у больной М. automated calculation of the values of three discriminant functions in patient M.

Показатели/ Parameters	Индивидуальное значение/ Individual value	Коэффициенты/Coefficients			Функции/Functions
		Прогрессирования нет в течение 3 лет/ No progression for 3 years	Прогрессирования нет 6–12 мес/ No progression for 6–12 months	Прогрессирования нет 12–24 мес/ No progression for 12–24 months
					F 0	F6–12	F 12–24
CD3+CD4+	54,8	0,39	0,24	0,39	21,37	13,15	21,37
T-reg	39,1	0,0095	0,12	0,066	0,37	4,69	2,58
Constant		-9,86	-6,70	-11,57	-9,86	-6,70	-11,57

11,88    11,14   12,38

Для автоматизации расчетов по модели на основе табличного процессора Microsoft Excel был создан файл с встроенными математическими функциями. Индивидуальные показатели больных вносили в маркированную область. Остальные графы содержали коэффициенты для расчета функций F (табл. 3–5). При сравнении полученных значений трех классификационных функций делали выбор в пользу той функции и заключения, при которой полученный F имеет максимальное значение, т.е. дискриминантная мощность является наиболее высокой.

Клинические примеры использования разработанного алгоритма

Клинический пример 1

Пациент П., 50 лет. Диагноз: Рак среднегрудного отдела пищевода IIIВ стадии (T3N2M0), 14.09.15 выполнена операция в объеме субтотальной резекции пищевода с одномоментной пластикой желудочным стеблем. Используя иммунологические параметры больного в каждом из 3 уравнений, при расчете с помощью автоматизированного окна установлено, что F0=0,39×23,5+0,0095×24,6– –9,8=-0,46; F6–12=0,24×23,5+0,12×24,6-6,7=1,89; F12–24=0,39×23,5+0,066×24,6-11,57=–0,78 (табл. 3). Полученные данные позволяли сделать заключение о высоком риске прогрессирования РП в сроки 6–12 мес после операции на основании выбора наибольшего значения (F6–12=1,89). Действительно, при СРКТ-котроле (13.05.16) выявлено метастатическое поражение внутригрудных лимфоузлов, гидроторакс справа. Бессобытийный период составил 8 мес.

Клинический пример 2

Пациентка М., 57 лет. Диагноз: Рак среднегрудного отдела пищевода II стадии (T2N0M0), 20.08.15 оперирована в объеме субтотальной резекции пищевода с одномоментной пластикой желудочным стеблем. При использовании аналогичного алгоритма получено, что F0=0,39×54,8+0,0095×39,1– –9,86=11,88; F6–12=0,24×54,8+0,12×39,1-6,7=11,14; F12–24=0,39×5–4,8+0,066×39,1–11,57=12,38 (табл. 4). Полученные расчетом данные позволяли предположить высокий риск прогрессирования рака пищевода в сроки 12–24 мес после хирургического лечения (максимальный F12–24=12,38). В июле 2017 г. при СРКТ выявлено метастатическое поражение внутригрудных лимфоузлов, легких. Бессобытийный период составил 22 мес.

Клинический пример 3

Пациент С., 54 года. Диагноз: Рак среднегрудного отдела пищевода II стадии (T3N0M0), 14.04.15 выполнена операция в объеме субтотальной резекции пищевода с одномоментной пластикой желудочным стеблем. При расчете риска прогрессирования рака пищевода с учетом иммунологических параметров больного установлено, что F0=0,39×35,5+0,0095×4,7––9,86=4,03; F6–12 0,24×35,5+0,12×4,7 -6,7=2,38; F12– 24=0,39×35,5+0,066×4,7-11,57=2,59 (табл. 5). Полученные в результате расчетов данные позволяли сделать заключение об отсутствии риска про-

Таблица 5/table 5

Автоматизированный расчет значений трех дискриминантных функций у больного С. automated calculation of the values of three discriminant functions in patient c.

Показатели/ Parameters Индивидуальное значение/ Individual value Прогрессирования нет в течение 3 лет/ No progression for 3 years Коэффициенты/Coefficients Прогрессирования нет 6–12 мес/ No progression for 6–12 months Прогрессирования нет 12–24 мес/ No progression for 12–24 months Функции/Functions F0 F6–12 F 12–24 CD3+CD4+ 35,5 0,39 0,24 0,39 13,85 8,52 13,85 T-reg 4,7 0,0095 0,12 0,066 0,04 0,56 0,31 Constant -9,86 -6,70 -11,57 -9,86 -6,70 -11,57 грессирования в течение 3 лет после операции на основании выбора наибольшего значения (F0=4,03). При динамическом наблюдении в течение 3 лет не было выявлено признаков прогрессирования заболевания.

Прогнозирование течения онкологических заболеваний, в частности РП, является актуальной задачей современной онкологии, для решения которой могут быть использованы не только клинические, но и лабораторные, например иммунологические, критерии. Учитывая высокую значимость факторов локального иммунитета в обеспечении взаимодействия опухоль-организм, мы исследовали возможную прогностическую роль субпопуляций лимфоцитов в опухоли при РП. Несмотря на то, что были изучены субпопуляции, противоопухолевое значение которых описано в литературе [11–14], в том числе и нами при РП, такие как CD8+ и NK-клетки, дискриминантная мощность этих показателей оказалась незначительной и не позволила включить их в прогностический алгоритм. На основании высоких значений F-статистики при разведочном этапе дискриминантного анализа были отобраны CD4+ Т-клетки и T-reg. Однонаправленность их прогностической роли, показанной в данной работе, вероятно, объясняется иммунофенотипическим сходством за счет экспрессии обеими субпопуляциями CD4. При этом известно, что CD4+ клетки, присутствующие в опухоли, в значительной мере представлены T-reg [15–17], в чем проявляется один из аспектов «иммуноредактирования» опухоли.

4,03 2,38 2,59

Выбор максимального значения рассчитанных функций F0, F6–12 и F12–24 по величинам иммунологических показателей конкретного больного позволил получить индивидуальный прогноз риска прогрессирования РП в разные периоды времени после операции. Как известно, ведущим фактором прогноза при РП является распространенность процесса. Однако применение разработанного подхода в клинической практике свидетельствует о том, что в ряде случаев менее распространенный процесс при неблагоприятном иммунологическом микроокружении демонстрирует более высокий риск прогрессирования. Таким образом, разработана дискриминантная модель определения индивидуального риска прогрессирования плоскоклеточного рака пищевода на основании исследования субпопуляций внутриопухолевых лимфоцитов, которую целесообразно использовать в клинике.

Заключение

С помощью метода дискриминантного анализа разработана модель прогнозирования риска прогрессирования плоскоклеточного рака пищевода после хирургического лечения с использованием наиболее значимых различий по параметрам содержания CD3+CD4+ и T-reg в опухоли, что говорит об их существенной роли во взаимодействии между опухолью и организмом опухоленосителя. Расчет функции F по данным каждого больного в сопоставлении с индивидуальной динамикой течения заболевания позволил обосновать прогностический алгоритм для возможной разработки персонализированного подхода к лечению таких больных.