Индуцированная алкоголем экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста и структурные изменения кардиомиоцитов крыс

Введение. Негативное влияние этанола на организм, в т.ч. на деятельность сердечно-сосудистой системы, является общепризнанным и доказанным фактом. Однако выраженность его воздействия в зависимости от дозировки и концентрации в крови в полной мере не определена.

Изучение реакции клетки на недостаток или избыток кислорода имеет большое значение для понимания адаптивных и дезадаптив-ных (патологических) процессов в организме, а нарушение баланса между потребностью и доставкой кислорода является основной причиной миокардиальной недостаточности [1]. Одним из транскрипционных регуляторов генов, ответственных за реакцию клетки на снижение кислорода, является гипоксией индуцированный фактор-1-альфа (HIF-1α), обеспечи- вающий адекватный ответ на гипоксический стресс [2].

При изучении проблемы гипоксического воздействия на организм выявлены морфофункциональные точки приложения (объекты), принимающие участие в развитии адаптации клетки к гипоксии [1–3], важная роль в котором отводится HIF-1α [4].

Известно, что в нормальных условиях HIF-1α характеризуется коротким периодом полураспада, а его концентрация поддерживается на низком уровне [5].

Количество данных об участии HIF-1α в адаптационных и дезадаптационных процессах увеличивается с каждым годом. Исследования ведутся по нескольким направлениям: изучение специфических механизмов регулирования активности HIF-1α; определение роли генов-мишеней в биологических процессах, регулирующихся, в частности, HIF-1α, внутри клеток и при патофизиологических состояниях; развитие технологий для поиска клеточных специфических мишеней.

В последние десятилетия широко изучаются регуляторные механизмы синтеза, процессинга и стабилизации HIF-1α [6, 7]. По мнению N.L. Morris, S.M. Yeligar, влияние этанола на гипоксией индуцированный фактор-1-альфа состоит в повышении экспрессии HIF-1α как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях в обработанных этанолом клетках в нормоксических условиях [8]. Одним из возможных объяснений является способность этанола смещать окислительно-восстановительное равновесие, усугублять митохондриальный стресс и увеличивать использование кислорода, создавая гипоксическую среду, стимулирующую экспрессию HIF-1α [9].

Исследованиями ряда авторов установлено, что увеличение уровня HIF-1α приводит к повышению экспрессии генов, обеспечивающих стимулирование ангиогенеза через ген фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A [10–12].

Показано, что VEGF-A активно экспрессируется в кардиомиоцитах и миофибробластах, что указывает на его аутокринную/пара-кринную роль в регуляции функции роста и выживания этих клеток [13–15].

Клиническое значение сосудисто-эндотелиального фактора роста неоднозначно и противоречиво. Ряд исследователей считает, что VEGF-A может оказывать влияние на формирование структурно-функциональных изменений сердечно-сосудистой системы, в частности нарастание индекса массы миокарда левого желудочка, появление или персистирование клинически значимых аритмий были связаны со снижением активности VEGF-A [16]. По мнению других авторов, немедленные эффекты VEGF-A, вероятно, носят адаптивный характер, тогда как отсроченные могут ассоциироваться с возникновением неблагоприятных клинических событий [17].

Научная гипотеза исследования состоит в том, что воздействие алкоголя вызывает внутриклеточную гипоксию, которая обусловливает увеличение уровня HIF-1α, что приводит к экспрессии гипоксия-зависимых генов, стимулирующих ангиогенез (ген VEGF-A) и адаптацию клетки к гипоксии.

VEGF-A относится к гепаринсвязываю-щим белкам и считается наиболее мощным проангиогенным фактором роста, участвующим в ангиогенезе [18–20].

В некоторых работах показано нарушение сигнализации VEGF-A и транслокации HIF-1α в эндотелиальных клетках крыс при воздействии этанола, что сопровождалось снижением сосудистости раны, обусловленным в т.ч. продуктами метаболизма этанола. Однако автор подчеркивает, что этанол не является фактором снижения секреции VEGF-A, а вызывает нарушение ответа эндотелиальных клеток на проангиогенные стимулы [21]. Выявленное увеличение HIF-1α как в ядерной, так и в цитоплазматической фракции обработанной этанолом клетки в нормоксических условиях свидетельствует о влиянии этанола на окислительно-восстановительные процессы, усилении митохондриального стресса, утилизации кислорода и создании тем самым гипоксической среды, способствующей повышению экспрессии HIF-1α [22].

Цель исследования. Выявить влияние этанола на экспрессию связанных с гипоксией генов (HIF-1α, VEGF-А) и структурные изменения в кардиомиоцитах здоровых крыс.

Материалы и методы. Эксперименты проводились c соблюдением рекомендаций Всемирной медицинской ассоциации Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects (1964), в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей, а также принципами надлежащей лабораторной практики (приказ Министерства здравоохранения РФ от 01.04.2016 № 199н, ГОСТ Р 53434–2009). Протокол эксперимента был одобрен этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет».

С целью изучения механизма алкоголь-индуцированного повреждения миокарда проводилась оценка морфологических и биомар-керных показателей. Структурные изменения кардиомиоцитов под воздействием этанола изучались на 60 беспородных половозрелых крысах (30 самцов и 30 самок). Средний возраст самцов составлял 39 (37–40) нед., самок – 41 (39–44) нед., что соответствует молодому возрасту человека (1 нед. жизни крыс – 1 год жизни человека) [23]. Масса тела самок составляла 334 (324,75–344,25) г, самцов – 474,5 (468–480) г.

После фиксации животным контрольной группы вводился интрагастрально стерильный 0,9 % водный раствор хлорида натрия, остальным животным – 40 % этанол ежедневно из расчета 10 мл/кг, чтобы животные достигли легкой степени опьянения, при которой количество этанола в крови составляет от 0,5 до 1,5 ‰ [24, 25]. Спустя 1 ч производился забор 0,5 мл крови из хвостовой вены и определялась концентрация этанола методом газовой хроматографии на хроматографе Agilent 6850 (США). Морфологическое исследование сердца животных проводилось после декапитации под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Длительности воздействия этанола на миокард составляла 4 и 8 сут. Сроки (4-е и 8-е сут) проведения эксперимента выбраны на основе результатов ранее проведенного нами исследования, в котором аналогичным образом и при равных условиях проводилась оценка минимальных алкоголь-индуцированных изменений миокарда при ежедневном выведении животных из опыта и дальнейшем морфологическом исследовании. В ходе этого эксперимента было установлено, что минимальные морфологические изменения возникали с 4-х сут воздействия этанолом; 8-е сут эксперимента выбраны для сравнения с минимальными изменениями (4-е сут), так как предполагалось прогрессивное по силе негативное воздействие этанола на миокард. Исходя из этих данных в следующей серии экспериментов проводилось сопоставление ранних морфологических изменений миокарда с геномным ответом кардиомиоцитов (экспрессия иРНК HIF-1α, VEGF-A).

Для анализа экспрессии мРНК генов HIF-1α и VEGF-A брался участок левого желудочка в области верхушки сердца размером 0,5×0,5 см и фиксировался в растворе IntactRNA (ООО «Евроген», Россия) на 4-е и 8-е сут алкогольной интоксикации. Для выделения РНК из 100 мг фиксированной ткани использовался реактив ExtractRNA (OOO «Евроген», Россия). В последующем образцы подвергались обратной транскрипции (набор MMLV RT) и ПЦР. ПЦР в реальном времени проводилась в триплетах в двух сериях с использованием набора qPCRmix-HS SYBR на амплификаторе CFX-96 (BioRad, USA) на базе Научно-исследовательского медико-биологического центра Ульяновского государственного университета. Использовались праймеры (табл. 1), синтезированные на базе ООО «Евроген». Температура отжига для HIF-1a составляла 59 °С, для VEGF-A, β-actin – 60 °С. Подбор праймеров проводился с использованием программы Primer Express 3.0.1. Для приблизительного расчета температуры отжига праймера применялась формула Tm=2(A+T)+4(G+C). Температура корректировалась для совместного использования прай-меров в ПЦР. Анализ уровня мРНК HIF-1α и VEGF-A в ткани сердца проводился через нормализацию гена house-keeping – β-actin и расчет нормализованной экспрессии, выраженной в log10. Данные прологарифмированы по log10, чтобы выровнять разбросы. Нормализованная экспрессия для таргетных генов оценивалась автоматически при помощи программного обеспечения к прибору CFX96 Manager (BioRad, USA) по итогам полуколиче-ственной ПЦР-РВ через ссылку-мишень по формуле: Normalized Expression Sample GOI=RQ sample GOI/(RQ sample (Ref1)×RQ sample (Ref2)×…×RQ sample (Refn))/n (RQ – относительное количество пробы; GOI – интересующий ген (одна мишень); ссылка – ссылка-мишень в прогоне, содержащая одну или несколько ссылок-мишеней (генов или последовательностей) в каждой пробе).

Таблица 1

Table 1

Primers

Исследуемый ген Investigated gene	Последовательность олигонуклеотидов Oligonucleotide sequence	Температура отжига, °С Annealing temperature, °C
HIF-1α	Forward TCC CTT TTT CAA GCA GCA G Reverse GCT CCA TTC CAT CCT GTT CA	59
VEGF-A	Forward GCA CCC ATG GCA GAA GG Reverse CTC GAT TGG ATG GCA GTA GCT	60
β-actin	Forward GAA GTG TGA CGT TGA CAT CCG Reverse TGC TGA TCC ACA TCT GCT GGA	60

Праймеры

Венозная кровь в объеме 1,5 мл для анализа уровня VEGF-A забиралась путем пунк-тирования правого предсердия.

Сывороточная концентрация VEGF-A оценивалась в сыворотке крови набором реактивов «Вектор-Бест» (Россия) (чувствительность 10 пг/мл, диапазон измерений 0–2000 пг/мл) на иммуноферментном анализаторе Hospitex diagnostics Plate Screen (Италия).

Морфологические исследования миокарда левого желудочка сердца проводились по гистологическим срезам методом световой микроскопии. Для этого образцы тканей левого желудочка сердца фиксировались в 10 % нейтральном растворе формалина с последующей проводкой и заливкой в парафин. Гистологические срезы толщиной 5–7 мкм окрашивались гематоксилин-эозином и по Ван-Ги-зону. Микропрепараты анализировались с помощью микроскопа Carl Zeiss Axiostar plus с последующей фотофиксацией на фотокамере Canon PC 1049. При морфологическом исследовании визуально оценивалось стромально-кардиомиоцитарное состояние гистологических образцов тканей.

Статистическая обработка данных осуществлялась при помощи статистического пакета SPSS версии 24.0. Результаты оценок по- казателей представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25 % – Q75 %). Для определения значимости различий между двумя наблюдениями использовался непараметрический U-критерий Манна – Уитни с дальнейшей оценкой соответствующего ему уровня значимости. Различие между сравниваемыми показателями считались достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Концентрация этанола в крови у крыс составляла 0,92 (0,78–1,10) ‰ и не имела достоверных гендерных различий. По мнению ряда авторов, данная концентрация сопоставима с легкой степенью алкогольного опьянения у человека [24, 25].

Миокард контрольных (интактных) животных имел типичное строение (рис. 1). Пучки кардиомиоцитов ветвились слабо, были разделены тонкими соединительнотканными перегородками. Цитоплазма кардиомиоцитов преимущественно гомогенна, хорошо выражена поперечная исчерченность. Ядра кардиомиоцитов палочковидной формы, располагались по центру клетки. Между пучками волокон большое количество капилляров, часть из которых содержала эритроциты.

Рис. 1 . Миокард интактных беспородных белых крыс: 1 – прослойки рыхлой соединительной ткани;

2 – цитоплазма кардиомиоцитов с поперечной исчерченностью;

3 – ядро кардиомиоцита; 4 – капилляры.

Окраска гематоксилином и эозином, ×400

Fig. 1. Myocardium of intact outbred white rats (control). Hematoxylin and eosin staining (original magnification, ×400). Note: 1 – interlayers of loose connective tissue;

• 2    – cytoplasm of cardiomyocytes with transverse striations;

• 3    – cardiomyocyte nucleus; 4 – capillaries

Некоторые морфологические изменения миокарда крыс выявлялись после 4- и 8-дневного воздействия этанола (рис. 2) и не имели гендерных различий. Миокард данных животных имел типичное строение. Пучки кардиомиоцитов располагались преимущественно параллельно, незначительное их количество имело извитой ход. Поперечная исчерченность выражена, ядра палочковидные, располагались по центру клеток. Сосуды между пучками и в соединительных перегородках полнокровны. Обнаруживался стаз эритроцитов как в капиллярах (рис. 2, Г), так и в артериолах и венулах (рис. 2, А). В цитоплазме ряда кардиомиоцитов определялись признаки как пылевидной жировой дистрофии (рис. 2, А), так и зернистой дистрофии цитоплазмы (рис. 2, Б). Вокруг некоторых крупных кровеносных сосудов хорошо вы- ражены пучки коллагеновых волокон, имевшие извитой ход (рис. 2, В).

Таким образом, короткое по продолжительности воздействие этанола сопровождалось признаками жировой и зернистой дистрофии цитоплазмы кардиомиоцитов с явлениями стаза эритроцитов в капиллярах, артериолах и венулах.

Однако выявленные морфологические изменения в кардиомиоцитах полностью относить к проявлениям гипоксического морфогенеза не следует, учитывая отсутствие такого характерного признака, как гидропическая дистрофия [26], – одного из типичных проявлений ранней обратимой стадии гипоксического повреждения клетки, приводящего к утрате трансмембранного градиента электролитов [27].

Рис. 2. Миокард беспородных белых крыс после воздействия этанола (8 дней):

A: 1 – стаз эритроцитов в микроциркуляторном русле миокарда;

2 – пылевидная жировая дистрофия кардиомиоцитов;

Б: 1 – зернистая дистрофия цитоплазмы кардиомиоцитов;

В: 1 – соединительнотканные образования вокруг кровеносного сосуда;

Г: 1 – стаз эритроцитов в капиллярах миокарда.

Окраска гематоксилином и эозином, ×400

Fig. 2. Myocardium of outbred white rats after ethanol exposure (8 days).

Hematoxylin and eosin staining (original magnification, ×400).

Note: A: 1 – erythrocyte stasis in the myocardial microcirculatory bed;

• 2 – dustlike fatty degeneration of cardiomyocytes;

Б: 1 – granular degeneration of cardiomyocyte cytoplasm;

• В:    1 – bundles of collagen fibres around the blood vessel;

Г: 1 – erythrocyte stasis of in myocardial capillaries

Согласно современным концепциям адаптации, при воздействии экспресс-фактора клетка активирует транскрипционные факторы, в частности HIF-1α, который регулирует гены, детерминирующие в т.ч. неоваскуляризацию миокарда и энергетический метаболизм кардиомиоцитов [28, 29]. В группе интактных крыс исходный уровень экспрессии мРНК HIF-1α в миокарде составил 1,47 отн. ед. у самок и 1,56 отн. ед. у самцов, что почти в 1,5 раза ниже, чем в группе крыс, подвергнутых воздействию этанола. Сывороточная концентрация VEGF-А также была ниже по сравнению с группой крыс, подвергнутых воздействию этанола (табл. 2).

Проведенная оценка экспрессии гипо-ксия-ассоциированных факторов кардиомиоцитов крыс под воздействием этанола, представленная в табл. 2, свидетельствует об изменении показателей экспрессии и об однонаправленности этих изменений.

Следует отметить наличие гендерных различий реакции на этанол, в частности более выраженной экспрессии мРНК HIF-1α на фоне 4- и 8-дневного воздействия этанола, а также более высокой сывороточной концентрации

• VEGF-A на фоне 4-дневного воздействия этанола у самок по сравнению с самцами. Увеличение длительности алкогольного воздействия до 8 сут сопровождалось ростом экспрессии мРНК VEGF-A как у самок, так и самцов крыс.

Таблица 2

Table 2

Гендерные особенности алкоголь-индуцированной реакции кардиомиоцитов Gender-specific characteristics of alcohol-induced cardiomyocyte reaction

Параметр Parameter	Контроль (n=20) Control (n=20)		Группа особей с алкогольной интоксикацией, 4-е сут (n=20) Rats intoxicated with alcohol, Day 4 (n=20)		Группа особей с алкогольной интоксикацией, 8-е сут (n=20) Rats intoxicated with alcohol, Day 8 (n=20)
	самки (n=10) females (n=10)	самцы (n=10) males (n=10)	самки (n=10) females (n=10)	самцы (n=10) males (n=10)	самки (n=10) females (n=10)	самцы (n=10) Males (n=10)
Экспрессия мРНК HIF-1α, отн. ед. HIF-1α mRNA expression, relative units	1,47 (1,36–1,67)	1,56 (1,47–1,67)	2,56 (2,53–2,67) *, **	2,36 (2,28–2,44) *	2,69 (2,55–2,80) *, **	2,32 (2,15–2,45) *
Экспрессия мРНК VEGF-А, отн. ед. VEGF-A mRNA expression, relative units	1,61 (1,42–1,86)	1,39 (1,29–1,52)	2,42 (2,30–2,48) *, ***	2,29 (2,09–2,54) *, ***	2,97 (2,66–3,01) *	2,71 (2,48–2,92) *
VEGF-А, пг/мл VEGF-A, pg/ml	43,15 (38,75–44,55)	43,45 (40–45,47)	54,1 (51,6–59,15) *, **	50,05 (47,32–53,15)	46,3 (41,65–49,15)	47,55 (45,82–50,7)

Примечание. * – достоверные различия с контрольной группой; ** – достоверные различия внутри группы; *** – достоверные различия между подгруппами особей одного пола.

Note. * – the differences are significant compared with the control group; ** – the differences are significant within a group; *** – the differences are significant compared with the subgroups of the same sex.

Общепризнано, что HIF-1α относится к универсальным сигнальным белкам, участвующим в реализации компенсаторно-приспособительных процессов в организме при гипоксии различного генеза [1, 30]. По мнению ряда авторов, HIF-1α является триггером, запускающим системные тканевые механизмы адаптации [31].

Повышение капилляризации миокарда крыс при действии этанола, сопровождающееся повышением сосудистой проницаемости, свидетельствует о развитии компенсаторно-приспособительных реакций на гипо- ксию, ассоциированную с экспрессией HIF-1α [32, 33].

Результаты нашего исследования показали, что кратковременное 4- и 8-дневное воздействие этанола, соответствующее легкой степени алкогольной интоксикации, вызывает активацию транскрипционных факторов HIF-1α и VEGF-А кардиомиоцитов крыс, что может быть расценено как механизм срочной адаптации без развития выраженных структурных дезадаптационных перестроек миокарда. Результаты исследования согласуются с данными других авторов [17, 34–36].

До настоящего времени остаются дискуссионными вопросы о кардиопротекторных и кардиодепрессивных эффектах алкоголя. Проводимые молекулярно-генетические исследования частично объясняют механизм действия этанола через модулирующий эффект на внутриклеточные сигнальные системы, что отражает адаптивную реакцию клетки вследствие экспрессии ряда белков [37]. При этом этанол запускает каскад реакций за счет кислородных сенсоров клетки, сигналы от которых активируют транскрипционный фактор HIF-1α [10]. Многочисленные исследования последних лет уделяют большое внимание изучению генетических аспектов компенсаторно-адаптационных реакций клетки на гипоксию, ведущая роль в них отводится специфическому регуляторному белку HIF-1α [38].

Известно, что HIF-1α регулирует экспрессию генов ангиогенеза, клеточной пролифе рации, апоптоза и т.д. [39–41]. Активация VEGF-A индуцирует экспрессию эндотелиальной NO-синтазы и образование оксида азота, что в свою очередь способствует вазодилятации [42]; снижение уровня VEGF-A обусловливает апоптоз эндотелия [43]. По мнению A. Bâ, алкоголь не столько нарушает структуру кардиомиоцитов, сколько повышает вероятность активации апоптического механизма [44], что нашло свое косвенное подтверждение в проведенном нами исследовании в виде отсутствия выраженного структурного ремоделирования кардиомиоцитов миокарда крыс. Экспериментально доказанным механизмом кардиопротек-торного эффекта умеренных доз алкоголя является повышение активности NO-синтазы [45], тирозинкиназы, АТФ-зависимых калиевых каналов [46, 47]. Перспективным является продолжение изучения молекулярно-генетических механизмов патогенеза алкогольного поражения миокардиоцитов и роли эндотелиальной синтазы оксида азота с учитом имеющихся в литературе данные о дозозависимом эффекте оксида азота: кардиопротекторном – при низких концентрациях и кардиодепрессивном – при высоких [37].

Выводы: