Индуцируемые низкоинтенсивным красным светом защитные фотоэффекты

Мониторинговые исследования состояния озонового слоя (как части атмосферы), проводимые в разных частях Земли, констатируют о прогрессирующем разрушении озонового слоя, связанном с антропогенным воздействием на окружающую среду. Вследствие этого увеличивается интенсивность проникновения в приземные слои атмосферы наиболее опасного вида УФ излучения – средневолнового (УФ-Б 280-320 нм), что ведет к целому ряду негативных последствий для человека: преждевременному старению, учащению случаев рака кожи (меланомы), катаракты, ослаблению иммунитета. Возникновение при воздействии УФ-излучения молекулярных повреждений ДНК, не устраняемых (или устраняемых не полностью) репаративными системами клетки, а также фотодеструкция белков и биомембран обусловливают развитие довольно многочисленных биологических эффектов. Согласно «Приложению I к Венской Конвенции по охране озонового слоя» в настоящее время приоритетными признаны исследования по изучению молекулярных принципов функционирования клеточных защитных механизмов, способных обеспечить устойчивость биосистем в условиях повышенного уровня радиации, способных защитить клетки от этих видов излучения [1].

Известные процессы репарации и фотоин-дуцированной защиты клеток, уменьшающие повреждающие эффекты УФ-излучения средне-(СУФ) и длинноволнового ультрафиолета (ДУФ), сходны в том, что активным в инициации этих процессов является свет видимого и/или ДУФ-диапазонов спектра [2-4] и направлены они на устранение либо предотвращение образования пиримидиновых димеров в ДНК. Ранее нами было показано [5], что защитить клетки от средневолнового УФ-облучения (290-320 нм) можно воздействием длинноволнового света с максимумом эффективности в красной области при 680 нм. Полученный нами спектр действия обнаруживал главный

максимум в красной области при 680 нм, небольшой максимум при 430-440 нм и имел достаточно сложную структуру (рис. 1) [5].

Рис. 1. Спектр действия фотоактивации клеток, инактивированных СУФ-излучением

Установленная форма дозовых кривых (рис. 2а и 2б) отличается от известных дозовых кривых (характерных для ферментативной фотореактивации), которые при достаточно высоких дозах синего света достигают уровня насыщения. Используя указанные различия, мы предприняли попытку разделить 2 типа фотореактивации, изменяя соответствующие режимы облучения синим светом, который активен как в ферментативной фотореактивации, так и в ФР₆₈₀. Эти эксперименты мы проводили только на клетках S.cerevisiae , поскольку используемый в работе штамм дрожжей C.guilliermondii не способен к ферментативной фотореактивации, т.е. УФ-инактивированные клетки не восстанавливаются при пострадиационном действии больших доз синего света.

а)                                                                  б)

Рис. 2: а) зависимость фотовосстановления СУФ-инактивированных клеток от дозы облучения монохроматическим светом в области 405-578 нм. Доза облучения 2,4 кДж/м². Каждая точка отражает среднее значение из 6 экспериментов; б) зависимость фотовосстановления СУФ-инактивированных клеток от дозы (времени) облучения монохроматическим светом в области600-730 нм: 1 – 730 нм; 2 – 710 нм;

3 – 610 нм; 4 – 630 нм; 5 – 660 нм; 6 – 680 нм. Доза облучения – 2,4 кДж/м2

Опыты проводились по следующей схеме: сначала клетки облучали фиксированной дозой СУФ-света (2.4 кДж/м²), а затем подвергали их воздействию монохроматического света 405 нм разной интенсивности: ® 0,2 Вт/м² в первые 30 мин и ~ 1,5 Вт/м² при дальнейшем облучении этой же суспензии. Из полученных данных (рис. 3) отчетливо видно наличие 2 форм кривых фотореактивации: одной (при малых временах и дозах облучения – кривая 1), характерной для ФР 680 , и второй (кривая 2, имеющая насыщение при больших временах и дозах облучения), типичной для ферментативной фотореактивации. Важно подчеркнуть, что ФР 680 проявляется и при понижении температуры до 4 ° С во время действия фотореактивирующего света (рис. 2) (ферментативная фотореактивация в таких условиях как известно, не наблюдается [2, 4]). Этот факт может указывать на фотохимическую природу процессов, протекающих на начальной (световой) стадии ФР 680 .

Последующие эксперименты показали, что понижение температуры до 4 ° С в период между облучением клеток реактивирующим светом и их высевом на питательную среду приводит к постепенному снижению эффективности ФР 680 и к полному её исчезновению к 3 ч выдерживания. По-видимому, такой период времени необходим для завершения тех фотоиндуцированных биохимических процессов в клетке, которые в итоге приводят к реализации эффекта ФР 680 .

Рассмотренные выше данные свидетельствуют о наличии у дрожжей S.cerevisiae 2 различных фотореактивирующих систем, направленных на увеличение выживаемости СУФ-инактивиро-ванных клеток – ФР680 и ферментативной фотореактивации. Используя ранее найденые оптимальные режимы облучения, мы выявили эффект фотовосстановления ДУФ-инактивированных клеток. Установлено, что повышение уровня выживаемости таких клеток наблюдается при воздействии света всех использованных ранее длин волн в диапазоне 400-730 нм, причем максимальный эффект фотореактивации проявлялся при облучении клеток красным светом 680 нм.

Рис. 3. Зависимость фотовосстановления СУФ-инактивированных клеток от дозы (времени) облучения монохроматическим светом 405 нм при 22⁰С (кривая 1) и 4⁰С (кривая 2). Доза СУФ-излучения – 2,4 кДж/м² (≈ 30% выжываемости)

Кроме того, на эффективность фотореактивации (как и при ФР680 в случае действия СУФ-излучения) понижение температуры до 4°С во время облучения монохроматическим светом не влияет. Поскольку, СУФ- и ДУФ-индуцированные повреждения могут ликвидироваться системами репарации ДНК [6], из которых основными являются «темновые», (т.е. не нуждающиеся в свете) – эксцизионная и пострепликативная. Они менее специфичны, чем фотореактивация, и наряду с димерами способны устранять и другие повреждения структуры ДНК, однако механизм их работы сложнее и включает несколько последовательных стадий, контролируемых разными ферментами.

Нам представлялось целесообразным проверить, не связано ли действие обнаруженной нами защитной системы с фотоиндуцированной активацией этих репарационных систем. Для решения поставленного вопроса мы исследовали способность к фотореактивации (680) мутантных штаммов дрожжей ( S.cerevisiae ), дефицитных по эксцизионной ( rad 3-2 ) и пострепликативной ( rad 50-1 ) репарации ДНК. Предварительно было показано, что такие клетки более чувствительны к СУФ ( rad 3-2 ) и ДУФ ( rad 50-1 ) по сравнению с диким штаммом. Опыты по фотореактивации проводились по следующей схеме: клетки дикого штамма и мутантов rad 3-2 или rad 50-1 облучали фиксированной дозой СУФ (2,4 кДж/м²) или ДУФ (18 кДж/м²), после чего их подвергали воздействию монохроматического света 680 нм.

Рис. 4. Зависимость фотовосстановления СУФ- и ДУФ-инактивированных дрожжевых клеток от дозы (времени) облучения монохроматическим светом 680 нм

Как следует из полученных данных (рис. 4), фотореактивация мутантных штаммов наблюдается, причем ее эффективность примерно такая же, как и у дикого штамма. Эти данные могут указывать на то, что устранение СУФ-, ДУФ-индуци-рованных повреждений ДНК в процессе фотореактивации (680) осуществляется без участия эксцизионной и пострепликативной репарации. Очевидно, действие фотоиндуцированной защитной системы включает какой-то другой механизм ликвидации таких повреждений.

Выводы: обнаружение эффекта фотовосстановления при инактивирующем воздействии ДУФ-света является первым указанием на возможность фоторепарации повреждений, образующихся по фотодинамическому механизму в генетическом аппарате клетки с участием эндогенных фотосенсибилизаторов [7]. Проанализировав экспериментальные данные, мы пришли к выводу, что обнаруженная нами защитная система действует по общему первичному механизму, запускаемому одним клеточным фоторецептором. Данные о её высокой квантовой чувствительности, а также триггерном характере действия указывают на существование весьма эффективных механизмов биохимического усиления, которые инициируются первичным фоторецептором и способны обеспечить устойчивость клеток при инактивирующем действии оптического излучения различных длин волн экологического диапазона.