Индукция бактерицидной активности разлагаемыми имплантатами

За последние десять лет достигнут значительный прогресс в разработке хирургических технологий реконструкции кости с использованием биорезорбиру-емых имплантатов, обладающих остеоиндуктивной активностью. Первые фиксирующие устройства, изготовленные из биоразлагаемых материалов, стали доступны с начала 1980-х годов [1, 2]. Они до сих пор используются в травматологии в качестве штифтов и винтов и позволяют избежать операции по удалению имплантата [3-7]. Такие штифты в основном изготовлены из полимолочной кислоты и не обладают остеогенной активностью, а заживление перелома происходит в обычные сроки [4, 8].

Риски септических осложнений после внутреннего остеосинтеза не являются незначительными. Исследования, направленные на повышение биоактивности полимерных имплантатов, наполненных антибиотиками (Биоматрикс, Алломатрикс-имплант, Остеоматрикс,

КоллаПан G, КоллаПан L), продемонстрировали эффективность данного подхода [9, 10]. Однако матрица таких имплантатов имеет форму мелкозернистого материала или тонкой волокнистой пленки. Таким образом, они не обеспечивают стабильного остеосинтеза. В моделировании методом наплавления [11] для печати имплантатов с 3D-структурой в настоящее время используются нити из линейных биорезорбируемых полиэфиров, таких как полимолочная кислота (PLLA), поликапролактон (PCL), полигликолевая кислота (PGA) и их сополимеры. Насыщение этих имплантатов антибиотиками может обеспечить антимикробную активность, связанную со структурной целостностью и контролируемой резорбцией имплантата.

Цель – оценить in vitro бактерицидную активность имплантатов, изготовленных из разлагаемого материала (поликапролактона), пропитанного гидроксиапатитом и антибиотиком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Два типа образцов имплантатов были изучены in vitro . Тип 1 имел форму интрамедуллярной спицы, используемой в ортопедической хирургии (цилиндрические образцы PCL длиной 10,0 мм и шириной 2,4 мм). С его использованием оценивалась доступность антибиотиков. Для изучения бактерицидной активности использовали диски диаметром 10 мм и толщиной 1 мм, изготовленные из PCL с помощью технологии 3D-печати. Диски имели ячейки диаметром 1-1,5 мм, ограниченные перекладинами диаметром 1 мм (как имплантаты, предназначенные для лечения дефектов кости). Поверхность всех имплантатов была пропитана цефотаксимом, который относится к антибиотикам широкого спектра действия.

Имплантаты были разработаны и изготовлены в Томском политехническом университете. Компонентами для приготовления композиционных материалов служили ε -поликапролактон (Sigma-Aldrich, США; Mn 80000) и гидроксиапатит (Fluidinova, Португалия; 10 ± 5 мкм). Для приготовления композита PCL растворяли в ацетоне особой чистоты («ЭКОС-1», Россия) в концентрации 15 мас. %. Гидроксиапатит (ГА) предварительно измельчали в шаровой мельнице в керамической камере с керамическими мелющими телами с добавкой ацетона в массовом соотношении 1,5:1 при скорости вращения 72 об/мин в течение 12 часов. После измельчения ГА в камеру добавляли раствор PCL и перемешивали в шаровой мельнице. После сушки полученный композит измельчали в низкоскоростной полимерной дробилке (Shini SG-1621N, Тайвань). Измельченные композиты экструдировали с помощью одношнекового экструдера Filabot EX2 (Filabot, США) с получением нитей диаметром 4 мм. Кроме того, частицы ГА наносились на поверхность имплантата путем погружения в суспензию порошка ГА и антибиотика цефотаксима в растворителе, а затем высушивались для удаления остатков растворителя.

Для изучения гидролитической деградации каждый цилиндрический образец из PCL (n = 6), импрегниро-ванный антибиотиком, помещали в отдельную измерительную ячейку, заполненную дистиллированной водой, объем которой определялся из расчета 4 мл на 1 см2 поверхности образца. Далее образцы инкубировали в термостате при температуре 37 °С. Инкубационную среду меняли ежедневно. Гидролизат подвергали химическому анализу на содержание антибиотика, которое определяли на спектрофотометре по интенсивности поглощения на длине волны 243 нм относительно стандартной калибровочной кривой. Продолжительность инкубации составила 7 дней.

Для выявления бактерицидной активности применяли диско-диффузионный метод определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам [12].

Для оценки антибактериальных свойств использовали следующие штаммы микробов: Staphylococcus aureus ATCC 25923 (грамположительные бактерии), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (грамотрица-тельные бактерии) и Escherichia coli АТСС 25922 (кишечные бактерии). Условия культивирования тест-микроорганизмов: тест-микроорганизмы культивировали на говяжье-пептонном агаре (МПА) при 37 °С в течение 24 часов. Рабочую суспензию тест-культур готовили из культуры данного тест-штамма, выращенной на плотной питательной среде (МПА) при 37 °С в течение 24 часов. Питательной средой для оценки бактерицидных свойств продуктов служил агар Мюллера-Хинтона. Для приготовления инокулята использовали метод прямого суспендирования колоний чистой культуры бактерий в стерильном изотоническом растворе 18-24-часовой, выращенных на плотной неселективной питательной среде (МПА). Плотность суспензии составляла 0,5 стандарта мутности МакФарланда.

На суточную свежую среду микробной тест-культуры наносили диски тестируемых продуктов. Время между подготовкой микробного культурного газона и нанесением на него дисков составляло не более 15 минут.

Контролем служили диски без покрытия фосфатом кальция и без антибиотиков. Другими типами были диски, покрытые гидроксиапатитом и антибиотиком (1), диски, покрытые только антибиотиком без гидроксиапатита (2), диски, покрытые только гидроксиапатитом (3).

Инкубация после наложения дисков проводилась при температуре 35 ± 1 °С и продолжалась 18 часов. Всего проведено 36 исследований (n = 6 на каждый вид тестируемых образцов).

Бактерицидную активность имплантата оценивали по зоне задержки роста тестируемых микроорганизмов вокруг дисков. Проверка проводилась в отраженном свете. При измерении зоны задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста.

Бактерицидную активность препаратов считали значимой, если зона задержки роста вокруг дисков составляла более 1 мм.

Статистический анализ проводился с использованием программы AtteStat 13.1 (Россия). Определяли медианные значения (Me), стандартное отклонение (SD), а также нижний и верхний квартили (Q1-Q3). Оценку нормального распределения выборок проводили с помощью критерия Шапиро – Уилка.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование показало, что 82,6 % антибиотика высвободилось в первый день инкубации (табл. 1). За этот период незначительно увеличилась масса образцов, что можно объяснить поглощением воды полимером. В остальные дни периода наблюдения значимого изменения массы проб не происходило. Целостность всех образцов за весь период инкубации сохранялась.

Контрольные диски, нанесенные на газоны от всех видов бактерий, не оказали бактерицидного действия. Вокруг дисков наблюдался непрерывный рост микробных культур (рис. 1). У всех образцов зона задержки ро- ста вокруг дисков не определялась (табл. 2). Эта серия подтвердила, что матрица имплантата из чистого поликапролактона не оказывает бактерицидного действия.

Диски образца 3, покрытые только гидроксиапатитом (без антибиотика), показали бактерицидное действие только в отношении культуры Escherichia coli (рис. 2, в). Зона задержки роста у этих образцов в среднем превышала 4 мм (табл. 2).

Диски с антибиотиком или антибиотиком в сочетании с гидроксиапатитом продемонстрировали значительное ингибирование роста бактерий (рис. 3).

Таблица 1

Рис. 1. Модифицированный диско-диффузионный метод определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, отсутствие зоны ингибирования роста: а – S. aureus ; б — P. aeruginosa ; в – E. colli

Средние значения содержания цефотаксима в гидролизате и средний вес образцов

Сутки инкубации	САНТ, мг/см2, М ± SD	В АНТ , V	Масса, мг	% изменения массы от исходного уровня (0)
0	0	0	66,2 ± 2,9	0
1	0,534 ± 0,074	82,6	66,5 ± 3,0	100,5
2	0,044 ± 0,009	8,2	66,4 ± 2,8	99,8
3	0,019 ± 0,012	3,6	66,3 ± 2,9	99,8
4	0,022 ± 0,008	4,0	66,0 ± 3,0	99,6
5	0,004 ± 0,001	0,8	66,0 ± 3,0	99,6
6	0,002 ± 0,001	0,4	65,9 ± 3,0	99,6
7	0,002 ± 0,001	0,4	65,5 ± 2,9	99,3
Итого за 7 дней	0,627 ± 0,050	100	–	–