Индукция физиологической активности чистой культуры гриба вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus) на лабораторной стадии

Введение . В результате стабильного увеличения объемов производства и совершенствования технологических приемов промышленного культивирования не прекращаются теоретические и экспериментальные исследования высших базидиомицетов, к которым относятся практически все традиционно употребляемые человеком съедобные грибы [1]. Поскольку культура формируется еще на лабораторной стадии разводочного цикла, в разносторонних исследованиях высших базидиомицетов особое место занимает оптимизация физиологического и, как следствие, технологического потенциала чистой культуры [2].

Показатели характеризующие различные векторы метаболизма в разных фазах роста мицелиальных грибов, позволяют получить наиболее полную информацию о физиологически значимых процессах, происходящих в культивируемой биомассе. К таким показателям следует отнести потребленный кисло-род/потребленная глюкоза, потребленный кис-лород/общий азот, общий азот/сухая масса и др. [8–10].

В этой связи актуальными остаются дальнейшие исследования особенностей культивирования, определение условий, способствующих более быстрому росту и накоплению биомассы, подбор наиболее сбалансированных питательных сред для воспроизводства чистой культуры, разработка надежных методов контроля на лабораторной стадии разводочного цикла [3–7, 11].

Цель исследования. Оптимизация лабораторной стадии разводочного цикла чистой культуры и разработка достоверных методов контроля физиологической активности биомассы.

Конструирование сбалансированных питательных сред для воспроизводства чистой культуры, разработка надежных методов контроля на лабораторной стадии разводочного цикла остаются актуальными и при существующем уровне развития отрасли.

Материал и методы исследования. Физиологическая активность чистой культуры на питательных средах с различными видами клетчатки оценивалась нами по скорости захвата субстрата (мм/сут или дм²/сут) и показателю дыхательной активности – потребленный кислород (мл О 2 ) на единицу площади колонии (дм²) за единицу времени (час).

Чистую культуру выделяли из свежих плодовых тел грибов вешенка ( Pleurotus ostreatus ), приобретенных в торговой сети и у мелких производителей. Отбирались экземпляры хорошо сформированные, не поврежденные, без заметных признаков порчи и болезней. Кусочки первичного посевного материала, вырезанные стерильным скальпелем из плодового тела, отбирались с соблюдением всех требований микробиологической техники, исключающих вторичное инфицирование инокулята.

Первичный посев производили в чашки Петри с 2,5%-м сусло-агаром (СА), приготовленным из пивного сусла, содержащего 3 % СВ (сухих веществ), 0,5 % дрожжевого автолизата и антибиотик (гентамицин – 0,3 мл препарата на 100 мл среды).

Культуры инкубировали при температуре 24– 25оС до полного захвата поверхности агара (9– 10 дней). В течение этого времени регистрировали характер роста и выбраковывали чашки с признаками постороннего роста, с деформированными или содержащими различного рода включения колониями вешенки, что является свидетельством либо деградации культуры, либо ее скрытыми поражениями. Партии грибов, в которых выявлялась хотя бы одна колония с выраженными признаками деградации или болезни, выбраковывались полностью.

Для дальнейших исследований отбирались чашки с колониями, полностью соответствующими требованиям здоровой и активной культуры: белые без включений колонии, правильной формы с ровными краями, с хорошо сформированными волновыми кольцами. Чашки с выбранными колониями упаковывались в стерильные полиэтиленовые пакеты и хранились при 2– 4оС до использования.

Для постановки эксперимента СА с грибным мицелием из одной чашки нарезался круглым штампом ∅ 5,5 мм. Полученные блоки извлекались стерильной иглой и переносились в центр заранее приготовленных контрольных чашек с 2,5%-м СА, приготовленным из пивного сусла, содержащего 3 % СВ, 0,5 % дрожжевого автолизата и антибиотик в указанной выше дозе. Опытные среды, кроме перечисленных ингредиентов, вносили в дозе 2 % к объему среды тщательно измельченные источники целлюлозы: микрокристаллическая целлюлоза, лузга подсолнечника, очищенные от примесей пшеничные отруби, сухие опавшие листья каштана, сухие опавшие листья ясеня, лигнин гидролизный, мезокарпий грейпфрута, опилки бука. Чашки с инокулятом инкубировали при 24–25^оС до полного захвата поверхности агара. В течение этого времени регистрировали скорость захвата поверхности среды и характер роста. Выбраковывались чашки с признаками постороннего роста и с деформированными или содержащими различного рода включения колониями вешенки.

Контрольные измерения скорости роста производили на 3-й, 5-й, 7-й и 10-й день инкубирования.

Определение показателя дыхательной активности производили на 15-й день инкубирования. Для этого использовали манометрический прибор собственной конструкции, состоящий из стеклянного эксикатора, манометрической трубки (бюретки), заполненной окрашенной метиленовым синим дистиллированной водой, и компенсаторной колбы. На дно реактора наливали 600–700 мл 10%-го раствора NaOH, что позволяло получить 6500 мл (6,5 дм3) свободного объема. Затем устанавливали фарфоровую подставку, на которую выстраивали из каждой серии по 13 чашек с посевами (без крышек) мицелием вниз для свободного воздухообмена. С помощью перепускного краника столбик жидкости устанавливался на «0». С этого момента регистрировалась высота поднятия столбика жидкости (мл) в течение 3 часов, что должно соответствовать потребленному количеству кислорода за регистрируемый промежуток времени. Полученную величину пересчитывали на 1 час и единицу площади колонии (дм2).

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты эксперимента представлены в таблице. На 3-й день инкубации при оценке характера роста и измерении диаметра колоний установили, что как на контрольной, так и на экспериментальных средах единичные колонии росли со слабовыраженными неровностями по окружности, однако в процессе дальнейшего инкубирования такие неровности сглаживались и к 5–7-му дню не регистрировались. Средний диаметр колоний в контрольных чашках составил 22,4 мм (от 20,9 до 23,6), такого же диаметра колонии образовались на среде с целлюло- зой микрокристаллической – 22,4 мм (от 21,2 до 23,7), на среде с измельченной лузгой подсолнечника – 23,0 мм (от 22,0 до 23,8), с пшеничными отрубями – 21,8 мм (от 20,9 до 23,0), с измельченными листьями каштана – 22,5 мм (от 22,0 до 23,1), с лигнином гидролизным – 22,8 мм (от 22,0 до 23,2), с буковыми опилками – 20,6 мм (от 19,6 до 23,0), измельченным мезокарпием грейпфрута – 22,5 мм (от 21,5 до 23,5).

Соответственно этому площадь захвата колоний составила 393,88 мм2; 393,88; 415,26; 373,06; 397,40; 408,07; 333,12; 397,40 мм2 (рис. 1).

Показатели генеративной и дыхательной активности на различных субстратах

№ п/п	Источник углерода	3-й день		5-й день		7-й день		10-й день		О 2
		∅ мм	S мм2	∅ мм	S мм2	∅ мм	S мм2	∅ мм	S мм2	Всего	мл/дм2/ ч
1	Контроль	22,4	393,88	41,4	1345,45	69,6	3802,66	90,0	6358,50	4,5	0,1814
2	Целлюлоза	22,4	393,88	39,3	1212,42	70,1	3857,49	90,0	6358,50	5,2	0,2097
3	Лузга подсолнечника	23,0	415,26	51,0	2041,78	79,2	4924,02	90,0	6358,50	6,9	0,2782
4	Отруби пшеничные	21,8	373,06	44,1	1526,67	73,8	4275,45	90,0	6358,50	7,7	0,3105
5	Листья каштана	22,5	397,40	45,5	1625,14	71,6	4024,34	90,0	6358,50	7,1	0,2863
6	Гидролизный лигнин	22,8	408,07	54,1	2297,54	83,3	5447,02	90,0	6358,50	6,1	0,2460
7	Опилки бука	20,6	333,12	36,4	1040,09	66,3	3450,61	90,0	6358,50	6,5	0,2621
8	Мезокарпий грейпфрута	22,5	397,40	46,1	1668,28	72,5	4126,15	90,0	6358,50	6,5	0,2621

• ■  1 Контроль

• ■ 2 Целлюлоза

• ■  3 Лузга

• ■ 4 Отруби

• ■ 5 Каштан

• ■ 6 Лигнин

• ■  7 Бук

• ■ 8 Мезокарпий

Рис. 1. Площадь захвата на 3-й день инкубации, мм2

На 5-й день инкубации средний диаметр колоний в контрольных чашках составил 41,4 мм (от 36,5 до 47,0), на среде с целлюлозой микрокристаллической – 39,3 мм (от 37,3 до 42,3), на среде с измельченной лузгой подсолнечника – 51,0 мм (от 48,0 до 52,8), с пшеничными отрубями – 44,1 мм (от 39,3 до 48,5), с измельченными листьями каштана – 45,5 мм (от 43,3 до

• 48,1) , с лигнином гидролизным – 54,1 мм (от 51,3 до 58,9), с буковыми опилками – 36,4 мм (от 34,0 до 39,1), измельченным мезокарпием грейпфрута – 46,1 мм (от 42,8 до 49,2). Соответственно этому площадь захвата колоний составила 1345,45 мм²; 1212,42; 2041,78; 1526,67; 1625,14; 2297,54; 1040,09; 1668,28 мм²(рис. 2).

  
  
  

• ■  1 Контроль

• ■ 2 Целлюлоза

• ■  3 Лузга

• ■ 4 Отруби

• ■ 5 Каштан

• ■ 6 Лигнин

• ■  7 Бук

• ■ 8 Мезокарпий

Рис. 2. Площадь захвата на 5-й день инкубации

На 7-й день инкубации средний диаметр колоний в контрольных чашках составил 69,6 мм (от 65,3 до 73,9), на среде с целлюлозой микрокристаллической – 70,1 мм (от 68,3 до 73,3), на среде с измельченной лузгой подсолнечника – 79,2 мм (от 76,9 до 82,0), с пшеничными отрубями – 73,8 мм (от 70,4 до 78,6), с измельченными листьями каштана – 71,6 мм (от 64,5 до 75,8), с лигнином гидролизным – 83,3 мм (от 77,4 до 86,8), с буковыми опилками – 66,3 мм (от 64,4 до 70,0), измельченным мезокарпием грейпфрута – 72,5 мм (от 67,9 до 76,2). Соответственно этому площадь захвата колоний составила 3802,66 мм2; 3857,49; 4924,02; 4275,45; 4024,34; 5447,02; 3450,61; 4126,15 мм2 (рис. 3).

На 9-й день инкубации все среды были покрыты грибным мицелием, а на 10-й день в посевах с наиболее активным предшествующим ростом (целлюлоза, лузга, отруби, каштан, лигнин) регистрировался густой рост по стенкам чашек.

Выращенный мицелий, оцененный по культуральным свойствам, исследовали на дыхательную активность в манометрическом приборе.

В результате было установлено (рис. 4), что 13 чашек Петри с мицелием, выращенным на контрольной среде общей площадью 8,2660 дм², за 3 часа сместили водяной столбик на 4,5 мл по шкале бюретки, что соответствует объему потребленного кислорода. Из этого следует, что биомасса, выросшая на 1 дм² сусло-агара указанного состава, за 1 час израсходовала 0,1814 мл О 2 . Мицелий, выращенный на среде с микрокристаллической целлюлозой общей площадью 8,2660 дм², за 3 часа сместил водяной столбик на 5,2 мл по шкале бюретки, что соответствует объему потребленного кислорода. Из этого следует, что биомасса, выросшая на 1 дм² сусло-агара указанного состава, за 1 час израсходовала 0,2097 мл О 2 .

• ■  1 Контроль

• ■ 2 Целлюлоза

• ■  3 Лузга

• ■ 4 Отруби

• ■ 5 Каштан

• ■ 6 Лигнин

• ■  7 Бук

• ■ 8 Мезокарпий

Рис. 3. Площадь захвата на 7-й день инкубации, мм2

• ■  1 Контроль

• ■ 2 Целлюлоза

• ■  3 Лузга

• ■ 4 Отруби

• ■ 5 Каштан

• ■ 6 Лигнин

• ■  7 Бук

• ■ 8 Мезокарпий

Рис. 4. Активность потребления кислорода, мл/дм2/ч

Мицелий, выращенный на среде с лузгой подсолнечника общей площадью 8,2660 дм², за 3 часа сместил водяной столбик на 6,9 мл по шкале бюретки. Из этого следует, что биомасса, выросшая на 1 дм² сусло-агара указанного состава, за 1 час израсходовала 0,2782 мл О 2 .

В тех же условиях мицелий, выращенный на среде с пшеничными отрубями, за 3 часа сместил водяной столбик на 7,7 мл по шкале бюретки. Из этого следует, что биомасса, выросшая на 1 дм² сусло-агара указанного состава, за 1 час израсходовала 0,3105 мл О 2 .

Биомасса, выросшая на среде с измельченными листьями каштана, за 3 часа сместила водяной столбик на 7,1 мл. Из этого следует, что 1 дм² сплошного роста на этой среде за 1 час израсходовал 0,2863 мл О 2 .

Биомасса, выросшая на среде с гидролизным лигнином, за 3 часа сместила водяной столбик на 6,1 мл. Из этого следует, что 1 дм² сплошного роста на этой среде за 1 час израсходовал 0,2460 мл О 2 .

Мицелий, выращенный на среде с буковыми опилками общей площадью 8,2660 дм², за 3 часа сместил водяной столбик на 6,5 мл по шкале бюретки. Из этого следует, что биомасса, выросшая на 1 дм² сусло-агара указанного состава, за 1 час израсходовала 0,2621 мл О 2 .

Такой же результат показал мицелий на 13 чашках Петри, выращенный на среде с мезокарпием, за 3 часа сместивший водяной столбик на 6,5 мл по шкале бюретки, что соответствует объему потребленного кислорода. То есть биомасса, выросшая на 1 дм2 сусло-агара указанного состава, за 1 час израсходовала 0,2621 мл О2.

Выводы

• 1.    Культуральные свойства и линейные размеры прироста колонии за определенный промежуток времени не могут быть использованы в качестве единственного критерия оценки качества культуры.

• 2.    Оценка физиологической активности биомассы является необходимым критерием в комплексе требований, предъявляемых к качеству чистой культуры.

• 3.    Определение величины дыхательной активности вполне может быть объективным критерием оценки физиологического потенциала биомассы.

• 4.    Включение в состав питательных сред источников целлюлозы и других растительных полимеров положительно влияет как на морфологические, так и на физиологические свойства чистой культуры.

• 5.    Лучшими индукторами генеративной активности, использованными в эксперименте, являются лигнин гидролизный ( ∅ 8,33 мм), лузга подсолнечника ( ∅ 7,92 мм) и отруби пшеничные ( ∅ 7,38 мм).

• 6.    Лучшими индукторами физиологической активности, использованными в эксперименте, являются отруби пшеничные (0,3105 мл О 2 /дм²/ч), измельченные листья каштана (0,2863 мл О 2 /дм²/ч) и лузга подсолнечника (0,2782 мл О 2 /дм²/ч).