Индукция ионами ртути (II) микроядер в эритроцитах личинок зелёной жабы

Целью эксперимента, результаты которого изложены ниже, был анализ цитогенетических эффектов ртути в эритроцитах личинок зелёной жабы.

Материалы и методы исследований

Объектом исследований служили эритроциты головастиков зелёной жабы Bufo viridis (L.), находившихся на 46-й и 47-й стадиях развития [1] и отловленных в природном водоёме. Водоём представлял собой заброшенный котлован, вырытый под фундамент здания и обвалованный извлечённым из него грунтом. Поверхностные стоки в водоём отсутствовали. Он пополнялся только атмосферными осадками. Поэтому можно предполагать, что в его воде не было каких-либо активных ксенобиотиков, способных влиять на исследуемые параметры. Отловленных головастиков трое суток выдерживали в лабораторном аквариуме, затем делили на группы по 7 особей. Одна группа интактных животных служила контролем. Другие группы подвергали воздействию исследуемых факторов.

Мутагенный эффект ртути исследовали, используя водные растворы нитрата ртути, Hg(NO3)2×H2O квалификации ч.д.а. Группы головастиков B. viridis помещали в аквариумы с водой, содержащей нитрат ртути в концентрациях 5, 10, 20, 50, 100 и 150 мкг Нg+2/л. на 6, 12, 18 и 24 ч. По истечении установленного времени воздействия вещества, головастиков пересаживали в аквариумы с чистой водой, где их выдерживали 24 ч. для реализации индуцированных солью металла цитогенетических нарушений в эритроцитах. По окончании указанного времени у 5 случайно выбранных в каждой группе личинок отсекали заднюю треть хвостового плавника и готовили мазки крови. Контрольные группы животных в течение все- го времени эксперимента содержали в чистой воде и мазки крови от них готовили одновременно с мазками крови опытных животных. Мазки крови высушивали, затем фиксировали в течение 30 мин в охлаждённой смеси этилового спирта с уксусной кислотой (3:1) промывали дистиллированной водой и окрашивали азур-эозином по Романовскому.

Препараты просматривали при увеличении (100×15×1,5)× (микроскоп «Laboval 4»). На окрашенных препаратах подсчитывали по 2 тыс. нормальных эритроцитов от каждого животного, фиксируя при этом (дополнительно к количеству нормальных эритроцитов) число клеток с микроядрами (далее – МЯ) и ядерными аномалиями (далее – ЯА). Экспериментальный материал получен до опубликования классификации ЯА [2], поэтому МЯ типизировали в соответствии со схемой [3] Краткая характеристика аномалий приведена в примечании к таблице 1.

Частоты МЯ и ЯА выражали в долях от общего числа проанализированных эритроцитов и процентах. Достоверность различий между сравниваемыми частотами определяли с помощью критерия u для сравнения малых (р<0,2) и больших (p>0,8) долей после их φ –преобразования [4, с. 154-169]. Интерполяция эмпирического распределения величин теоретическим известным распределением выполнена с использованием программы Stadia 4.5.

Результаты и обсуждение

Результаты микроскопического анализа показаны в табл. 1.

Таблица 1 – Количество микроядер и ядерных аномалий различных типов в периферической крови личинок

B. viridis , индуцированное различными экспозициями и концентрациями ртути

Время воздействия, ч	Концентрация Нg+2, мкг/л	Всего клеток	Число клеток с микроядрами и ядерными аномалиями*
			1 а	1 б	1 в	1 г-I	г-II	1 д	1 е
Контроль		10042	18	19	4		1
6	5	10050	14	19	5	1	3	7	1
	10	10049	9	26	4	–	8	–	2
	20	10058	19	29	2	–	–	4	4
	50	10063	18	40	2	–	–	3	–
	100	10092	35	42	2	–	1	–	12
	150	10091	29	35	9	1	2	4	11
12	5	10068	22	25	2	1	11	4	3
	10	10076	29	21	8	–	5	9	4
	20	10118	32	58	4	2	4	6	12
	50	10103	35	28	14	2	7	11	6
	100	10119	39	43	6	–	8	9	17
	150	10114	41	32	19	1	4	7	10
18	5	10078	31	25	4	2	8	5	3
	10	10112	33	43	17	–	7	9	2
	20	10148	42	68	23	1	2	5	7
	50	10155	39	55	27	2	9	14	9
	100	10179	59	79	24	–	4	13	–
	150	10198	70	96	11	–	2	7	12
24	5	10099	29	41	19	–	3	4	3
	10	10106	34	36	14	1	9	8	4
	20	10162	47	72	19	3		7	14
	50	10160	43	54	24	4	16	11	8
	100	10182	43	95	18	3	–	6	17
	150	10194	66	83	32	2	–	4	7

*Примечание. Микроядра, изолированные от ядра (а), примыкающие к ядру (б), соединёнными с ядром нитью хроматина (в). Ядерные аномалии: неоформленного хроматиновый материал в виде палочек (г-I) или клубков (г-II), округлые образо- вания ядерного материала в виде лопастей (д), двуядерные» клетки (е).

Статистический анализ этих данных свидетель- статистически достоверному увеличению частоты ствует (табл. 2), что при 6-часовой экспозиции ртуть в аномалий. Экспозиции длительностью 12 часов и бо-концентрациях до 50 мкг/л не вызывала статистиче- лее вызывали статистически достоверное увеличение ски достоверного увеличения частот МЯ и ЯА. Одна- частот МЯ и ЯА при всех исследованных концентра-ко концентрации 100 и более мкг/л ртути приводили к циях.

Таблица 2 – Частоты эритроцитов с микроядрами в периферической крови личинок B. viridis после воздействия различных экспозиций и концентраций ртути

Время воздействия, ч	Концентрация Hg+2, мкг/л	Клеток с аномалиями		Критерий Фишера	Достоверность различий, Р
		количество	частота (р ±τ·σ р ), %
Контроль		42	0,42 ±0,13
6	5	50	0,50+0,14	0,73	>0,05
	10	49	0,49 ±0,14	0,63	>0,05
	20	58	0,58 ±0,15	1,50	>0,05
	50	63	0,63 ±0,15	1,95	>0,05
	100	92	0,91 ±0,19	4,29	<0,001
	150	91	0,90 ±0,18	4,22	<0,001
12	5	68	0,68 ±0,16	2,39	<0,05
	10	76	0,75 ±0,17	3,06	<0,01
	20	118	1,17 ±0,21	6,09	<0,001
	50	103	1,02 ±0,20	5,08	<0,001
	100	119	1,18 ±0,21	6,15	<0,001
	150	114	1,13 ±0,21	5,83	<0,001
18	5	78	0,77 ±0,17	3,22	<0,01
	10	109	1,11 ±0,20	5,69	<0,001
	20	148	1,46 ±0,23	7,92	<0,001
	50	155	1,52 ±0,24	8,43	<0,001
	100	179	1,76 ±0,26	9,62	<0,001
	150	198	1,94 ±0,27	10,60	<0,001
24	5	99	0,98±0,19	4,79	<0,001
	10	106	1,05 ±0,20	5,23	<0,001
	20	162	1,59 ±0,24	8,71	<0,001
	50	160	1,57 ±0,24	8,60	<0,001
	100	182	1,79 ±0,26	9,79	<0,001
	150	194	1,90 ±0,27	10,40	<0,001

Для определения силы влияния концентраций ртути и продолжительности её экспозиции на частоту индуцируемых МЯ был проведён двухфакторный параметрический дисперсионный анализ (табл. 3). Его результаты доказывают существование статистически достоверного отклика исследуемого параметра (частоты МЯ и ЯА) на оба фактора.

Таблица 3 – Результаты двухфакторного дисперсионного анализа влияния длительности экспозиции и концентрации ртути на частоту эритроцитов с МЯ в периферической крови личинок B. viridis.

Источник	Сумма квадратов	Число степеней свободы	Средняя сумма квадратов	Сила влияния факторов
Экспозиция	2,667	3	0,889	0,9696
Концентрация Нg+2	1,729	5	0,346	0,9292
Регрес.остатки	0,331	15	0,022
Общая вариация	4,728	23	0,206
F (Экспоз.)=40,3 F (Концент.)=15,7	Р<0,001 Р<0,001	Степ. свободы =3, 15 Степ. свободы = 4, 15		Есть влияние Есть влияние

Кроме интерфазных эритроцитов с МЯ и ЯА на препаратах были обнаружены аномальные эритроциты, находящиеся на стадии метафазы митоза. Анома- лии заключались в том, что эти клетки вместо полного набора хромосом содержала всего одну или несколько метафазных хромосом (рис. 1).

Рис. 1. Аномальные эритроциты с единичными метафазными хромосомами, возникшие после воздействия ртути

При сравнительном анализе частот различных МЯ и ЯА, индуцированных различными экспозициями ртути, видно некоторое уменьшение доли клеток с изолированными МЯ за счёт увеличения доли клеток с примыкающими МЯ, клеток с большими фрагментами хроматина и двуядерных клеток. Появление таких клеток свидетельствует о том, что неорганическая ртуть нарушает не только структуру хромосом, но и митотическое веретено деления и, возможно, механизмы цитокинеза. В настоящее время известно, что соединения ртути могут нарушать структуры клеточ- ного веретена благодаря аффинности к тиоловым группам. Аномальное распределение хромосом между делящимися клетками под влиянием НgCl2 ранее было обнаружено на клетках Vicia faba [5].

Зависимость частоты ядерных аномалий в эритроцитах личинок B. viridis от концентрации ртути при различной длительности экспозиции удовлетворительно интерполируется уравнениями вида · со следующими величинами коэффициентов (табл. 4).

Таблица 4 - Величины коэффициентов уравнения у=а+Ьx* , интерполирующих зависимость частоты микроядер и ядерных аномалий в эритроцитах личинок B. viridis от концентрации ртути при различной продолжительности ее воздействия

Длительность экспозиции, ч	а	b	R	F	P
6	0,389	4,36 ⋅ 10–2	0,968	59,3	1,00 ⋅ 10–4
12	0,596	5,56 ⋅ 10–2	0,829	8,8	1,90 ⋅ 10–3
18	0,625	0,119	0,947	34,9	2,00 ⋅ 10–4
24	0,707	0,111	0,918	21,3	4,00 ⋅ 10–4

Примечание: R – множественный коэффициент корреляции; F – значение критерия Фишера; Р – уровень значимости нулевой гипотезы.

Результаты исследований мутагенности ртути существенно зависят от химической природы образованного ею вещества и типа клеток, используемых для анализа.

Большинство бактериальных генетических тестов показали, что соединения ртути не мутагенны для прокариот. Объяснют это явление высокой рези- стентностью бактериальной клеточной мембраны к проникновению ионов ртути. У некоторых прокариот обнаружены ферментативные механизмы детоксикации неорганических и органических соединений ртути с использованием, соответственно, ртутной редуктазы (MerA) и ртутьорганической лиазы (MerB) [6].

У дрожжей хлорид ртути подавлял митотическую генную конверсию, что, возможно, связано с ингибированием ртутью ферментов репарации пред-мутационных повреждений [5].

Нитрат ртути в концентрации 1×10^–5 М не проявлял мутагенных свойств при воздействии на клетки корневой меристемы С. capillaris, но иодид ртути был мутагенен при значительно меньшей концентрации (3×10^–6 М) [7]. Хлорид ртути в концентрации 0,05 и 0,1%, хлорид этилртути (0,01-2,5%) и ацетат фе-нилртути (0,01-1,0%) вызывали аберрации хромосом, повышали частоту полиплоидных и двуядерных клеток в клетках меристемы корешков Allium сера, индуцировали у Vicia faba в мейозе образование МЯ и аберраций хромосом [8] Мутагенность ртути для растений Pisum sativum подтверждена исследованиями [9]

Доказана мутагенность различных соединений ртути для рыб [10-18]. Очень мало публикаций, освещающих вопросы мутагенности ртути для амфибий и пресмыкающихся. Установлено, что хлорид ртути (HgCl 2 ) и метилхлорид ртути (CH 3 HgCl) индуцировал нарушение митоза, разрывы хромосом и образование МЯ в клетках тритона Pleurodeles waltl [19]. В тканях кайманов, обитающих на территориях, прилегающих к горнодобывающим предприятиям Колумбии, установлено 6-15 кратное накопление ртути. У таких животных методом кометного анализа выявлено значительное увеличение частоты повреждений в ДНК [20]

Токсичность различных соединений ртути для птиц освещена во многих публикациях. Вместе тем публикаций результатов исследования мутагенности ртути и её соединений для птиц мы не обнаружили.

В культивируемых клетках млекопитающих ртуть даже при низких концентрациях индуцировала одноцепочечные разрывы ДНК. Соединения ртути увеличивали частоту мутирования в локусе тимидин-киназы в клетках лимфомы мыши [21], индуцировали сестринские хроматидные обмены и аберрации хромосом в культивируемых клетках СНО и лимфоцитах человека [22-24]. Эксперименты, выполненные с культурой эмбриональных фибробластов мыши, привели к заключению, что наблюдаемые мутации могут быть следствием окислительных процессов, а не прямым взаимодействием ртути с ядерной ДНК [25].

Соединения ртути, попадающие в организм млекопитающих, могут индуцировать точковые мутации, доминантные летальные мутации, хромосомные и геномные повреждения. Так, хлорид ртути в дозе 0,375 мг/кг внутрижелудочно вводимый крысам в течение 45 дней вызывал повреждения ДНК, обусловленные усилением окислительного стресса и митохондриальной дисфункцией [26]. Одноразовое внутрибрюшинное введение самцам крыс дихлорида ртути в количестве ЛД 50 и 2/3 ЛД 50 (7,5 мг/кг и 5 мг/кг, соответственно) приводило к статистически достоверному увеличению частоты МЯ в полихроматических эритроцитах костного мозга [27-28]. Хлорид ртути и хлорид метилртути индуцировали статистически достоверное увеличение частоты доминантных летальных мутаций у самок крыс и мышей [29-31].

У людей, употреблявших в пищу мясо и рыбу, загрязнённые соединениями ртути, а также лиц, подверженных в процессе профессиональной деятельности воздействию паров и аэрозолей ртутьсодержащих веществ, обнаруживали существенное увеличение частот сестринских хроматидных обменов, структурных и численных аберраций хромосом и МЯ в клетках различных тканей [32-35].

В последнее десятилетие получены сведения, указывающие на то, что ртуть может быть активна эпигенетически, поскольку способна влиять на метилирование ДНК у млекопитающих [36-37]. Широкое варьирование результатов исследования биологических свойств ртути может быть обусловлено не только различиями в протоколах и условиях экспериментов, но и различиями эпигенетических механизмов регуляции генов, участвующих в метаболизме ртути у организмов разных видов.

Заключение

Ртуть интенсивно используется в различных отраслях промышленности, и большое её количество поступает в окружающую среду с отходами, стоками и газовыми выбросами. Эксперты ВОЗ прогнозируют дальнейший рост концентрации ртути в окружающей среде в результате хозяйственной деятельности человека, а изменение климата, как ожидается, усугубит воздействие этого вездесущего загрязнителя. Токсичность ртути хорошо исследована, её канцерогенность остаётся предметом споров и дальнейших исследований онкологов. Факты мутагенность ртути установлены для растений и многих типов и видов животных. Вместе с тем степень изученности мутагенных эффектов у разных классов позвоночных животных очень различна. Мутагенность соединений ртути для амфибий, пресмыкающихся и птиц рассматривается в очень небольшом количестве публикаций. Полученные нами результаты доказывают потенциальную генетическую опасность неорганических соединений ртути для амфибий и указывают на необходимость генетического мониторинга животных, обитающих в водоёмах, расположенных в районах ртутного загрязнения экосистем.

Выводы

• 1.    Пребывание личинок зелёной жабы в воде содержащей 5, 10, 20 и 50 мкг/л ионов ртути в течение 6 часов приводит к некоторому повышению частот микроядер и ядерных аномалий в эритроцитах подопытных животных, но этот рост остаётся статистически недостоверным.

• 2.    Увеличение концентрации ионов ртути до 100 и 150 мкг/л при 6 часовой экспозиции вызывает статистически достоверное увеличение частот микроядер и ядерных аномалий в эритроцитах личинок.

• 3.    Воздействие ионов ртути в течение 12, 18 и 24 часов вызывало статистически достоверное увеличение частот микроядер и ядерных аномалий при всех исследованных концентрациях.