Инъекции инкапсулированного ph-сенсора SNARF-1 не вызывают явной реакции стресса у личинок эндемичных байкальских caddisflies Baicalina thamastoides

Микрокапсулы являются не только перспективным средством целевой доставки генно-модифицирующих векторов и лекарственных средств в ткани живого организма, но и могут быть использованы как носители широкого круга молекулярных сенсоров, спектр или яркость флуоресценции которых реагирует на такие параметры как pH, ионный состав и т. д. (Johnson & Spence, 2011). Микрокапсулы, наполненные флуоресцентными сенсорами и введённые в живой организм, являются перспективным инструментом для прижизненной оценки стрессовых состояний организма и могут найти широкое применение в экологическом мониторинге водных экосистем (Sadovoy et al. , 2012). Однако, введение микрокапсул в организм для регистрации физиологических параметров само по себе может сопровождаться реакцией защитных систем организма на введённые микрокапсулы, что может помешать адекватной оценке состояния организма с помощью микрокапсул. Это обуславливает необходимость предварительной оценки возможной стресс-реакции организмов на инъекции микрокапсул, особенно у видов, перспективных для использования в качестве тест-объектов.

В данной работе оценивали возможность развития стресс-ответа организма личинки ручейника при инъекции инкапсулированных сенсоров. В качестве стресс-маркера были использованы показатели активности трёх ферментов, играющих ключевую роль в функционировании защитных систем организма: супероксиддисмутазы (СОД), неспецифических эстераз (НЭ) и глутатион-S-трансферазы (ГСТ). СОД — это один из ключевых ферментов, ответственных за утилизацию активных форм кислорода, чья продукция в митохондриях увеличивается при множестве нарушений в организме. ГСТ и НЭ являются одними из основных ферментов системы детоксикации ксенобиотиков.

Активность ферментов оценивали в ответ на инъекции пустых микрокапсул и микрокапсул, содержащих флуоресцентный pH-сенсор SNARF-1. Также проводили оценку в ответ на инъекции физиологического раствора и раствора флуоресцентного сенсора.

MATERIALS AND METHODS

Подготовка микрокапсул

Микрокапсулы подготавливали методом наслоения противоположно заряженных полимеров. Вначале получали пористые ядра карбоната кальция, смешивая 0,625 мкл 1М раствора Na2CO3 и 0,625 мкл 1М раствора CaCl2 с 2 мл раствора декстрана, меченого чувствительным к pH флуоресцентным красителем SNARF-1 (Invitrogen, D-3304), с концентрацией 2 мг/мл, при интенсивном перемешивании. Через 10 с перемешивания полученные ядра карбоната кальция три раза отмывали осаждением с помощью центрифугирования и разведением в деионизированной воде. Поры ядер, сформированных в растворе меченого SNARF-1 декстрана, содержали данный краситель. Затем на ядра последовательно наносили слои положительно заряженного полимера полиаллиламин гидрохлорида (ПАГ; Aldrich, 2832315) и отрицательно заряженного полистиролсульфоната натрия (ПСН; Aldrich,

243051). Для этого ядра помещали в раствор соответствующего полимера с концентрацией 4 мг/мл (содержащий также 1М NaCl) на 5 мин при ультразвуковом воздействии для снижения агрегации ядер. Ядра трижды отмывали от раствора оставшегося полимера, после чего наслаивали второй полимер, а затем повторяли процедуру несколько раз. Для повышения биосовместимости покрывали полученные структуры дополнительным слоем cополимера поли-L-лизина и полиэтиленгликоля (ПЛЛ-ПЭГ; SuSoS, SZ34-67), экспонируя ядра в растворе данного полимера с концентрацией 2 мг/мл в течение двух часов. Наконец, ядра из карбоната кальция растворяли в 0,1М растворе ЭДТА c pH 7.0, после чего получали полые микрокапсулы с формулой стенки (ПАГ/ПСН) 5 -(ПЛЛ-ПЭГ), содержащие SNARF-1. Поскольку SNARF-1 ковалентно связан с декстраном, он не может покинуть полость микрокапсулы. Пустые капсулы получали аналогично, но без добавления меченого SNARF-1 декстрана при формировании ядер.

Измерение концентрации микрокапсул проводили в камере Горяева. Концентрации микрокапсул в растворах, использованных позже для инъекций, были доведены примерно до 6700 шт/мкл и 67000 шт/мкл для содержащих и не содержащих SNARF-1 микрокапсул соответственно. Данные концентрации выбраны, поскольку микрокапсулы с декстраном, меченым SNARF-1, оказались примерно в 5 раз крупнее микрокапсул без него (в среднем 5 мкм и 1 мкм соответственно) из-за различий в размерах кристаллизовавшихся ядер карбоната кальция. При выбранных концентрациях растворы микрокапсул обладают близкими суммарными площадями поверхности микрокапсул.

Отлов ручейников и проведение экспериментов

В качестве объекта данного исследования были выбраны личинки массового эндемичного вида ручейников Baicalina thamastoides Martynov, 1914, населяющие литоральную зону озера Байкал. Отлов производили с глубины 2-3 м в прибрежной зоне озера Байкал в п. Большие Коты в сентябре 2015 г. Вид определяли по (Timoshkin, 2004; Lepneva, 1964). Отловленные личинки ручейников были прикреплены к мелким валунам в тех местах, где отсутствовало обрастание водорослями. Температура отлова — 12 °C, при данной температуре животных содержали и проводили все последующие эксперименты. После отлова личинки ручейников были акклимированы к лабораторным условиям в течение 4-5 суток: их содержали в холодильнике в аквариумах по 2-3 л в хорошо аэрируемой байкальской воде при низком освещении. В аквариумы помещали небольшие валуны, схожие по форме с теми, к которым ручейники были прикреплены в естественной среде. Важно отметить, что покидание домиков личинками, свидетельствующее о стрессовом состоянии ручейника, в течение акклимации не наблюдали. При проведении экспериментов использовали только личинок без внешних паразитов и симбионтов.

Для проведения эксперимента ручейники были разделены на 5 групп: контрольная группа, оставленная в условиях акклимации, и 4 экспериментальные тест-группы. В жировые тела ручейников тест-групп делали инъекции, сопровождавшиеся последующим экспонированием животного под объективом флуоресцентного микроскопа Микмед-2 (ЛОМО) с зелёным освещением в течение около 30 с. Данное экспонирование имитировало процесс снятия сигнала с флуоресцентных сенсоров в тканях ручейника. Инъекции в личинки ручейников были следующих типов: введение физиологического раствора, введение «пустых» микрокапсул в физиологическом растворе, введение микрокапсул с флуоресцентным pH-чувствительным красителем SNARF-1, введение меченого SNARF-1 декстрана в физиологическом растворе. Концентрация декстрана, меченого SNARF-1, в физиологическом растворе составляла 0,2 мг/мл, что соответствует средней молярной концентрации SNARF-1, используемой для измерения pH на культурах клеток (Venn et al., 2009). Инъекции производили с помощью шприца на 100 мкл (Hamilton) с насаженной иглой с внешним диаметром 0,25 мм.

Перед инъекцией по центру длины домика личинки с латеральной стороны в нём делали отверстие размером 2-3 мм, мягко откалывая песчинки пинцетом. Через это отверстие под углом примерно 30 ° вводили 2 мкл соответствующего раствора в латеральную часть жирового тела личинки. После проведённых процедур животных возвращали в условия акклимации. Через сутки после инъекции и экспозиции под флуоресцентным микроскопом личинок быстро вынимали из домиков и фиксировали в жидком азоте.

Биохимические анализы

Зафиксированных в жидком азоте ручейников гомогенизировали полипропиленовым пестиком в фосфатносолевом буфере. Затем образцы центрифугировали при 10000 g 10 мин. Полученный супернатант использовали для определения активности ферментов. Активность СОД измеряли по методике (Beauchamp & Fridovich, 1971), активность НЭ — по методике (Serebrov et al. , 2006), активность ГСТ — по методике (Habig et al. , 1974) с модификациями (Timofeyev, 2010). Концентрацию общего белка определяли по методике Брэдфорд.

Активность СОД и НЭ измерена для 10 биологических повторностей в рамках каждой экспериментальной группы, активность ГСТ — для 4-12 биологических повторностей. Измерения проведены в трёх технических повторах для всех ферментов. Данные были проверены на соответствие нормальному распределению тестом Шапиро-Уилка, после чего логарифмированы для нормализации. Статистическую значимость различий оценивали однофакторным дисперсионным анализом. Статистический анализ проведён в пакете R (R Core Team, 2015).

RESULTS AND DISCUSSION

Полученные результаты приведены на Рис. 1. Как следует из представленных материалов и проведённого статистического анализа, для всех трёх ферментов не отмечено наличия статистически значимых отличий между выборками (P-значения равны соответственно 0,16, 0,9 и 0,37 для СОД, НЭ и ГСТ). В то же время, из ранее проведённых исследований на личинках ручейников известно, что экспонирование в присутствии различных токсикантов должно вызывать значительную реакцию антиоксидантной и детоксицирующей систем, в первую очередь СОД, ГСТ и экстераз (Xie et al., 2009; Berra et al., 2006). Таким образом, полученный в данной работе результат может свидетельствовать о том, что микрокапсулы (в том числе содержащие флуоресцентный краситель) нетоксичны, и их инъекции не вызывают развития стресс-реакции антиоксидантной и детоксицирующей систем у личинок ручейников B. thamastoides.

Следует отметить, что отсутствие токсичности микрокапсул может иметь и кратковременный характер, поскольку остается небольшая доля вероятности того, что ответ защитных систем может развиваться в другие временные точки после инъекции. Однако, в таком случае, воздействие непосредственно инъекции должно быть нивелировано через сутки содержания в условиях акклимации, в то время как ответ защитных систем на введённые в ткани микрокапсулы мог ещё не успеть развиться.

од

0,09

g 0,06 = I 0,05 ® 0,04 -

В 0,03 < 0,02 -0,01 0

Контроль       ФР          MK MK+SNARF-1-Д SNARF-1-Д

Figure 1. Активность СОД (A), НЭ (B) и ГСТ (C) в гомогенате тела личинки ручейников

B. thamastoides в контрольной группе и через сутки после инъекции физиологического раствора (ФР), пустых микрокапсул (МК), микрокапсул с содержанием SNARF-1 (МК+SNARF-1-Д) и раствора меченого SNARF-1 декстрана (SNARF-1-Д).

CONCLUSIONS

Таким образом, предварительные результаты наших исследований свидетельствуют в пользу нетоксичности и отсутствия выраженного стресс-ответа антиоксидантной и детоксицирующей систем у личинок B. thamastoides как на инъекции микрокапсул и экспонирование под флуоресцентным микроскопом, так и на инъекции инкапсулированного pH-сенсора SNARF-1. Возможность отложенных хронических эффектов на организм при применении инкапсулированных сенсоров, требует дальнейшего изучения, включающего большее количество временных точек и оцениваемых параметров стресс-реакции.

ACKNOWLEDGMENT

Коллектив авторов благодарит Адельшина Р.В. за помощь в отлове личинок ручейников, а также Рожкову Н.А., Мартемьянова В.В. и Меглинского И.В. за ценные рекомендации при проведении данной работы. Работа проведена при финансовой поддержке гранта РНФ (№ 15-14-10008).