Инфекции, связанные с образованием биопленок

Открытие и изучение биопленок является одним из наиболее важных достижений микробиологии за последние 30 лет. О растущем интересе к этой проблеме свидетельствует резкое увеличение числа публикацией на эту тему от единичных работ в 1980-х гг. до нескольких тысяч к середине 2000-х гг. [1].

Биопленка (англ. — Biofilm) представляет собой конгломерат колоний микроорганизмов, погруженных во внеклеточный матрикс и прикрепившихся к поверхности устройства или субстрата. Биопленки — это физические структуры, образуемые микробными сообществами, на поверхности раздела жидкой и твердой фазы.

По данным Американского центра контроля и профилактики заболеваний (CDC) с образованием биопленок протекают до 65% всех бактериальных инфекций [1].

Биопленочные инфекции чрезвычайно разнообразны, однако, их можно подразделить на 2 большие группы:

• 1)    хронические инфекции (хронический синусит, хронический средний отит, хронические раны, легочные инфекции у больных муковисцидозом, вентилятор-ассоциированные пневмонии и др.)

• 2)    инфекции, связанные с имплантируемым медицинским оборудованием (инфекция шунта ЦНС, кератит, обусловленный контактными линзами, катетер-ас-социированные инфекции, эндокардиты, связанные с искусственными клапанами, стент-ассоциированные инфекции, перипротезные инфекции, инфекции в области имплантов и др.).

Последние называют также девайс-ассоциированными инфекциями (от англ. Device — устройство).

К наиболее известным микроорганизмам, образующим биопленки, относятся: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa , хотя есть работы, демонстрирующие образование биопленок и другими микроорганизмами ( Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Escherichia coli , другими энтеробактериями, ацинетобактерами и др.) [1, 2]

Причем, биопленки могут быть образованы бактериями одного или нескольких видов.

Сами бактерии составляют лишь 5–35% массы биопленки. Они представлены так называемыми сессильными (англ. Sessilis — сидящий, оседлый), т.е. неподвижными клетками.

Микроорганизмы, вышедшие за пределы биопленки, называются планктонными или свободно плавающими. Последние притягиваются к влажным или загрязненным поверхностям и прилипают к ним под воздействием межмолекулярных сил (силы Ван-дер-Ваальса). Если микроорганизмы сразу не отделить от поверхности, то они «навсегда» прикрепятся к поверхности посредством ворсинок (пилей), т.е. наступит этап адгезии. При этом, бактериальный иноку-лум, равный 1000 КОЕ/мл, запускает инфекционный процесс.

Началом развития биопленок является прикрепление бактерий к поверхности инородного материала. Затем происходит созревание биопленки, во время которого микроорганизмы теряют подвижность, прикрепление становится необратимым, слой биопленки утолщается, образуются кластеры микроколоний [2].

По мере роста биопленки структура удерживается вместе и защищается выделенным внеклеточным полимерным веществом из липополисахаридов, гликопротеидов, протеогликанов, нуклеиновых кислот (для Pseudomonas aeruginosa — альгинатом). Подобно кровеносной системе биопленку пронизывают поры и каналы.

Через 9 дней от начала образования биопленки структура биопленочных кластеров изменяется и начинается процесс дисперсии (распада), во время которого бактерии способны активно покидать биопленку и возвращаться к планктонному образу жизни.

По мере того как биопленки превращаются в макроскопические трехмерные структуры, возможен отрыв участков биопленки, высвобождение миллионов микроорганизмов, которые могут перемещаться в организме с током крови, мочи, кишечного содержимого, имитируя метастазирование [2].

Образование биопленок — один из факторов патогенности микроорганизмов. Заключенные в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, микроорганизмы имеют измененный фенотип, проявляющийся другими параметрами роста и экспрессии специфических генов.

Существование бактерий внутри биопленок обеспечивает им много преимуществ по сравнению с отдельными клетками. Бактерии в биопленках обладают повышенной выживаемостью в присутствии агрессивных веществ, факторов иммунной защиты макроорганизма и антибактериальных препаратов.

Бактерии в биопленках остаются живыми даже в присутствии антибиотиков, добавленных в количестве 500– 1000 раз большем, чем их минимальная подавляющая концентрация (МПК) [3, 4]. Исследования показывают, что некоторые микробы, такие как кишечная палочка, становятся практически невосприимчивыми к антибиотикам из-за низкого уровня метаболической активности.

Применение антибиотиков, плохо проникающих в биопленку, очень быстро приводит к формированию и отбору устойчивых микроорганизмов. Неполная эрадикация микроорганизмов при биопленочных инфекциях в свою очередь способствует их персистенции и формированию хронических процессов [2, 5].

Введение антибиотика вызывает гибель части клеток, при этом другая часть клеток образует субпопуляцию клеток-персистеров. Персистеры находятся в состоянии метаболического покоя, сохраняют жизнеспособность под действием антибиотиков и способствуют восстановлению популяции микроорганизмов [6].

Микроорганизмы в биопленке формируют единую генетическую систему в виде плазмид — мобильных кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их трофические, энергетические и другие связи между собой и окружающей средой. Последнее называют «quorum sensing» или социальным поведением микроорганизмов. Оно позволяет бактериям действовать коллективно, подобно клеткам в многоклеточном организме. Считается доказанным, что социальное поведение микробов биопленки повышает вирулентность и патогенность всех возбудителей [2, 4, 5]. «Чувство кворума» как механизм межклеточной коммуникации было открыто 25 лет назад.

Именно благодаря биопленкам возникают трудности в микробиологической диагностике инфекции (возможность выявления только планктонных микроорганизмов, в отсутствие которых не удается определить этиологию инфекции), а также трудности в лечении (плохое проникновение большинства антибиотиков в биопленки и отсутствие эффекта антибиотиков из-за высокой антибиотико-резистентности микроорганизмов в биопленках).

Высокая устойчивость к антибиотикам проявляется значениями минимальных подавляющих концентраций, которые в десятки и сотни раз превосходят аналогичные значения для планктонных форм микроорганизмов (табл. 1). Для того, чтобы это преодолеть, необходимо использовать дозы антибиотиков, во много раз превышающие официально разрешенные дозы, что невозможно из-за развития побочных эффектов.

По некоторым данным до 80% микроорганизмов при биопленочной инфекции бывают мультирезистентными [8].

Наличие биопленок приводит к тому, что традиционные методы микробиологической диагностики выявляют не все микроорганизмы, участвующие в инфекционном процессе. Идентифицировать микроорганизмы в составе биопленок позволяют такие современные молекулярные методы, как электрофорез в геле и ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с флюоресцентной гибридизацией in situ , эпифлюоресцентная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM), ПЦР с обратной транскриптазой и другие исследования [9].

Наиболее широко изучены биопленки у пациентов с хроническими заболеваниями ЛОР-органов, с катетер-

Таблица 1. Сравнительная устойчивость планктонных и биопленочных бактерий [4]

Микроорганизмы	Антибиотик	МПК в жидкой среде, мкг/мл	МПК в биопленке мкг/мл
Staphylococcus spp .	Ванкомицин	2	20
E.coli	Ампициллин	2	512
Streptococcus sanguis	Доксициклин	0,063	3,15
Burkholderia pseudomallei	Цефтазидим	8	800

МПК — минимальная подавляющая концентрация антибиотика

ассоциированными мочевыми инфекциями. Также множество исследований были посвящены изучению образования биопленок на различных металлических устройствах, которые широко используются в медицинской практике (протезы, импланты и др.).

В процессе исследований определились классы антибактериальных препаратов, активных в отношении биопленок. Это — фторхинолоны (левофлоксацин и др.), макролиды (кларитромицин), липопептиды (даптомицин), глицилциклины (тигацил), рифамицины (рифампицин), липогликопептиды (телаванцин, далбаванцин), цефалоспорин 5 поколения (цефтаролин).

Ниже представлен ряд исследований воздействия антибиотиков на биопленки.

Одним из ранних исследований было изучение ингибирующего воздействие кларитромицина на гликокаликс, продуцируемый MRSA [10]. Оценивалось воздействие ванкомицина и кларитромицина на биопленку MRSA на экспериментальной модели осложненной инфекции мочевых путей у крыс.

Было отмечено, что монотерапия кларитромицином разрушала биопленку, но не приводила к эрадикации возбудителя (препарат не активен в отношении MRSA). Монотерапия ванкомицином приводила к эрадикации только планктонных форм MRSA с последующей репролиферацией при его отмене. Комбинированная терапия ванкомицином и кларитромицином позволяла достичь полной эрадикации как планктонных форм, так и микроорганизмов в составе биопленки.

В другом исследовании изучалось воздействие антибиотиков на стафилококковые биопленки на титановых поверхностях медицинского оборудования [11]. Fujimura S. et al. оценивали эффективность кларитромицина in vitro в сочетании с цефазолином или ванкомицином против биопленок Staphylococcus aureus , сформированных на устройствах из титана.

Несмотря на то, что биопленки S. aureus не были уничтожены монотерапией кларитромицином, цефазолином или ванкомицином, при комбинации кларитромицина и ванкомицина или кларитромицина и цефазолина отмечалось разрушение биопленок, а эрадикация S. aureus четко наблюдалась через 72 часа.

Интересным представляется воздействие кларитромицина на биопленки Pseudomonas aeruginosa — микроорганизма, на который кларитромицин не действует. Так, в исследовании Yasuda et al. изучалось влияние кларитромицина на биопленки синегнойной палочки, образованные на поверхности мембранного фильтра, который инкубировали вместе с P. aeruginosa в течение 10 дней. Образовавшиеся на мембранных фильтрах биопленки обрабатывали относительно низкой концентрацией кларитромицина в течение 5 дней, что приводило к эрадикации биопленок [12].

Обработка биопленок кларитромицином уменьшала количество альгината и гексозы. Уничтожение мембранных структур биопленок и уменьшение количества полисаха- ридов приводило к увеличению скорости проникновения антибиотиков через бактериальные биопленки.

При этом если одновременно с кларитромицином вводился активный в отношении P. aeruginosa антибиотик (в исследовании Yasuda et al. — офлоксацин), его эффективность при одновременном применении с кларитромицином повышалась [12].

Приведенные выше исследования продемонстрировали, что кларитромицин разрушает матрикс биопленок, независимо от его активности в отношении микроорганизмов, их образующих, поэтому может применяться не только в монотерапии (в случае доказанной или предполагаемой чувствительности), но и в комбинации со специфическими (например, антисинегнойными или антистафилококковы-ми) препаратами для повышения эффективности антибактериальной терапии.

Более современные исследования кларитромицина у больных реанимационного профиля показали улучшение результатов лечения при добавлении его к этиотропной терапии. Так, у 200 больных с нозокомиальным сепсисом на фоне вентилятор-ассоциированной пневмонии (ВАП) рандомизированным образом сравнивали кларитромицин и плацебо при их добавлении к терапии, которая применялась врачом-интенсивистом для лечения сепсиса и септического шока. При этом основными возбудителями инфекции в группе больных, получавших кларитромицин, были A.baumannii (54,5%), P.aeruginosa (25,8%) и K. pneumoniae — 7,6 %, в отношении которых кларитромицин не активен. Кларитромицин вводили в дозе 1 г в виде инфузии в течение 3 дней подряд, что позволяло создать концентрации, равные 5–10 мкг/мл, в сыворотке крови. Медиана времени до разрешения ВАП составляла 10,0 дней в группе, получавшей кларитромицин, в сравнении с 15,5 днями в группе плацебо (p=0,011), медиана времени до де-интубации — 16,0 дней против 22,5 дней (p=0,047). При этом риск смертности от любых причин в группе плацебо составлял 19,00, а в группе кларитромицина — 3,78 (p=0,043). Авторы предположили, что основной механизм действия был обусловлен действием кларитромицина на иммунную систему человека и влиянием на «чувство кворума» бактерий [13].

К сожалению, до сих пор не существует четких рекомендаций по дозам и режимам кларитромицина при его использовании с целью эрадикации биопленок. Кроме того, другому макролиду (жозамицину) не удалось в сравнительном исследовании продемонстрировать подобный эффект.

Большое количество работ посвящено лечению био-пленочных инфекций в урологии.

К числу заболеваний, связанных с присутствием биопленок, относятся и инфекции мочевыводящих путей (пиелонефрит, цистит, мочекаменная болезнь) [14, 15]. In vitro продукция биопленок отмечается у 63% штаммов E.coli и Klebsiella pneumoniae и 75% штаммов Pseudomonas aeruginosa . Среди пациентов с катетерами продукция биопленок микроорганизмами составляла 70,3% [8].

Широкое распространение и увеличение доли высокотехнологичных оперативных вмешательств в урологии, установка катетеров, стентов, дренажей и протезов также приводят к развитию биопленочной инфекции, зачастую нивелируя результаты операций.

Биопленки на поверхности уроэпителия легче поддаются эрадикации антимикробными препаратами по сравнению с биопленками, образующимися на чужеродных объектах, находящихся в мочевыводящих путях (катетеры).

Периодическое высвобождение планктонных форм бактерий из пленок в поток мочи служит источником поддержания хронического инфекционного и воспалительного процесса в почках. Бактерии в биопленках не только поддерживают хроническую инфекцию за счет повышенной устойчивости к терапии, но и способствуют камнеобразованию.

Микробная биопленка может становиться ядром камня в мочевыделительной системе. Считается, что до 30% камней являются инфекционными. За счет изменения защитного слоя уроэпителия и формирования на нем микробных биопленок в 5–6 раз увеличивается адгезия струвитных кристаллов [16, 17].

Штаммы E.coli, P. aeruginosa, K.pneumoniae, S.aureus , выделенные от больных хроническим пиелонефритом, по способности формирования биопленок значительно превосходят штаммы, выделенные от больных с острым пиелонефритом. При острых пиелонефритах максимальной пленкообразующей способностью обладают изоляты P.aeruginosa . Их пленкообразующая способность в 2–3 раза превосходила способность к формированию биопленок у штаммов энтеробактерий и стафилококков. Та же тенденция выявлена и среди возбудителей хронических пиелонефритов — максимальной способностью к плен-кообразованию обладали штаммы P.aeruginosa . В целом, среди изолятов микроорганизмов, выделенных от больных хроническими пиелонефритами, обнаружено значительное преобладание пленкообразующей активности по сравнению с микроорганизмами, выделенными при острых пиелонефритах. Различия были статистически значимы для штаммов E.coli (p<0,0001), P.aeruginosa (p<0,0001), K.pneumoniae (p<0,0222) и S.aureus (p<0,0279) [17].

Также было отмечено, что энтеробактерии, являвшиеся возбудителями пиелонефрита у больных с сопутствующей мочекаменной болезнью, в целом отличались достоверно большей способностью к пленкообразованию, по сравнению с возбудителями инфекций, протекающих без уролитиаза (p=0,0011). Отсутствие статистически значимых различий для штаммов P.aeruginosa и S.aureus авторы связали с небольшим объемом выборки [17].

Тец В.В. с соавторами (2008) изучали выживаемость бактерий в биопленках (под действием левофлоксацина, офлоксацина, норфлоксацина). Авторы оценивали действие антибиотиков на формирующиеся и сформированные (24-часовые) биопленки по количеству биомассы и количеству колоние-образующих единиц (КОЕ) микроорганизмов [18].

Антибиотики, добавленные в использованных концентрациях, не полностью блокировали образование биопленок, но у всех тестированных штаммов вызывали значительное снижение биомассы сообщества и числа КОЕ. Биомасса биопленок при добавлении испытанных препаратов снижалась на 30–70% по отношению к контролю. Левофлоксацин более других фторхинолонов снижал биомассу клебсиелл, кишечной палочки и псевдомонад [18].

Проведенные Тец В.В. и соавторами (2008) исследования показали, что использованные фторхинолоны действуют как на формирование, так и уже на существующие биопленки возбудителей уроинфекций. Способность левофлоксацина проникать через липидо-белковую поверхностную оболочку биопленок и действовать на находящиеся внутри бактерии практически важна, поскольку к моменту начала лечения биопленки бактерий в организме человека уже сформированы. Кроме того, выявленная способность левофлоксацина активно подавлять микроорганизмы в составе биопленок свидетельствует о снижении риска рецидивов при его использовании [18].

Относительно новым препаратом для лечения грампо-ложительных инфекций, включая MRSA, является дапто-мицин. Это единственный на сегодняшний день препарат из группы липопептидов. В процессе его изучения была показана активность в отношении биопленок, что вкупе с его активностью в отношении стафилококков, способствовало рекомендациям использовать данный препарат при эндопротезировании в ортопедии, а также при катетер-ассоциированных инфекциях кровотока [19]. В последнем случае, даптомицин является одним из двух бактерицидно действующих препаратов, активных в отношении стафилококков, включая их метициллин-резистентные варианты. Второй препарат — ванкомицин — практически не оказывает действия на биопленки. Рекомендаций по лечению инфекций кровотока путем добавления тех или иных ан-тибиопленочных препаратов к ванкомицину не существует.

При исследовании in vitro активности даптомицина в сравнении с ванкомицином и линезолидом было показано, что даптомицин обладает активностью в отношении как растущих бактерий, так и микроорганизмов в стационарной фазе, при этом его активность в отношении биопленок MRSA была выше таковых ванкомицина и линезолида [20].

В исследовании Smith K. et al. изучалась выживаемость MRSA в биопленке при применении различных антибиотиков (12 изолятов) и было показано, что степень выживания MRSA в биопленках была минимальной (4%) при применении даптомицина, 19% — при применении ванкомицина, 43% при применении тигециклина, 45% при применении линезолида, и 62% при применении клиндамицина [21].

Несмотря на то, что в данном исследовании имели место благоприятные для ванкомицина результаты, общее мнение сводится к тому, что этот высокоэффективный в отношении MRSA препарат плохо работает в отношении бактерий, находящихся в биопленках, а активен в отношении планктонных форм микроорганизмов.

В то же время его липидные деривативы — липоглико-протеиды — в частности, телаванцин, способны оказывать действие в отношении штаммов, продуцирующих биопленки. Так, в исследовании были продемонстрированы высокие МПК90 ванкомицина в отношении пленкообразующих штаммов S.aureus, S.epidermidis, E.faecalis (16, 4 и 16 мкг / мл соответственно) и низкие (0,06–0,25 мкг/мл для планктонных форм бактерий. МПК телаванцина не превышали 0,25 мкг/мл для планктонных форм и 0,25–1,0 мкг/мл для сессильных форм бактерий, что с уверенностью позволяет говорить об эффективности телаванцина для лечения биопленочных инфекций, вызванных S.aureus, S.epidermidis, E.faecalis . Это особенно важно, так как телаванцин используется для лечения нозокомиальных пневмоний (включая ВАП) и инфекций кожи и мягких тканей (включая раневые инфекции) и изучаются показания к его применению при инфекциях кровотока [22].

На примере in vitro модели биопленок изучалась эффективность тигециклина в отношении биопленок в сравнении с ванкомицином и даптомицином было показано, что ванкомицин оказывает бактерицидный эффект в отношении Staphylococcus spp. (включая MRSA), но только в отношении планктонных форм микроорганизмов. Даптомицин — проникает в биопленки, оказывает бактерицидный эффект, но не разрушает биопленку. Тигеци-клин — ингибирует образование и уничтожает биопленки и оказывает бактерицидный эффект на микроорганизмы в биопленке [23].

Тигециклин — препарат из группы глицилциклинов — обладает бактериостатическим механизмом действия. Он имеет широкий спектр антимикробной активности как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных микроорганизмов, включая их резистентные штаммы. FDA (США) предостерегло от использования тигециклина для лечения стафилококковых инфекций, в виду наличия широкого спектра препаратов с антиграмположительной активностью и трудностями лечения резистентных грамотрицательных инфекций, при которых может быть эффективен тигециклин.

В исследовании, выполненном Meeker D.G. et al., оценивались антибиотики, активные против MRSA, по их активности в сформировавшихся биопленках in vitro и in vivo . In vitro даптомицин и цефтаролин были сопоставимы по ингибирующей активности в отношении MRSA биопленок и превосходили по активности ванкомицин, телаванцин, оритаванцин, далбаванцин и тигециклин. In vivo у мышей только цефтаролин превосходил в ингибирующей активности ванкомицин [24].

Barber K.E. et al. (2014) исследовали синергизм двухкомпонентных комбинаций, включавших цефтаролин с даптомицином, ванкомицином или рифампицином. Комбинация цефтаролина и даптомицина по эффективности превосходила комбинации цефтаролина и ванкомицина, а также цефтаролина и рифампицина. Цефтаролин был активен в отношении даптомицин-нечувствительных

S.aureus и штаммов с промежуточной чувствительностью к ванкомицину (VISA). Цефтаролин уменьшает притяжение образующих биопленку бактерий к материалу протеза за счет изменения заряда клеточной мембраны [25].

Не только отдельные антибиотики могут воздействовать на биопленки. В ряде исследований изучалась действие на биопленки бактериофагов.

Бактериофаг (от лат. phages — пожирающий) представляют собой особую группу вирусов, которые избирательно вызывают лизис бактерий. Бактериофаги включают 13 семейств, подразделенных на более чем на 140 родов, содержащих более 5300 видов. Не вызывают заболеваний человека и животных. В хирургии бактериофаги стали применять с 1921 года.

Антибактериальный эффект бактериофагов обусловлен внедрением генома в бактериальную клетку с последующим размножением и лизисом инфицированной клетки

Бактериофаги обладают полисахарид-деполимеразой, которая может разрушать биопленки путем деградации экзополисахарида даже в том случае, если мутация фага блокирует инфицирование и лизис хозяина, что было показано при исследовании фаговой активности в биопленках Pseudomonas aeruginosa, E.coli, Enterobacter agglomerans и Staphylococcus aureus [26–28].

Carson L. et al. (2010) использовали литические фаги для предотвращения образования биопленок Proteus mirabilis и Escherichia coli при катетер-ассоциированных инфекциях мочевого тракта. После импрегнации катетера гидрогелем с литическим бактериофагом отмечалась постепенная редукция популяция биопленки на катетерах Фолея. На обработанных бактериофагами катетерах редукция образования биопленок составила 90% в сравнении с необработанными катетерами [29].

Таким образом, в настоящее время накапливается все больше данных о механизмах возникновения и развития биопленочных инфекций, которые получили широкое распространение в связи с увеличением количества инвазивных манипуляций с установкой различных инородных устройств (девайсов), в том числе и у онкологических больных. Поэтому знание особенностей течения биопленочных инфекций и возможностей воздействия на биопленки вооружает современного врача-онколога в борьбе с инфекционными осложнениями, возникающими в процессе противоопухолевого лечения.