Инновационные технологии в изучении явлений апоптоза

массива полученной на сегодняшний день экспериментальной информации невозможен без компьютерных методов ее систематизации и математического моделирования . В основе построения генных сетей лежит химико-кинетический подход, позволяющий представить любые процессы как сумму элементарных событий, оперируя концентрациями молекул и скоростями реакций, т.е. при моделировании генных сетей используется обобщенный химико-кинетический метод [2]. Кибернетическую основу генной сети составляют находящиеся в ней положительные и отрицательные обратные связи. Исследование генных сетей проводится с помощью компьютерных систем. Одним из ведущих программных комплексов в этой области является система GENENET [4], предназначенная для аннотации экспериментальных данных, представленных в научных публикациях, а также интеграции экспериментальной информации из компьютерных баз данных, получаемой в результате высокопроизводительных экспериментальных подходов (ДНК-чипы и др.). К числу таких подходов относятся : методы логического анализа структурнофункциональной организации генных сетей с использованием методов теории графов, методы математического моделирования динамики генных сетей, методы компьютерной геномики, транскриптомики, протеомики [3].

М атериал и методика исследований

В работе использованы вытяжки из колеоптиля озимой пшеницы (Triticum aestivum) сорта Колумбия в качестве индуктора апоптоза. Объектом исследования являлся горох (Pisum sativum) сорта Смарагд, восприимчивый к возбудителю корневых гнилей Fusarium oxysporum.

Эксперимент проводили на водных культурах. Для создания необходимых условий выращивания использовалась программируемая климатокамера “Фитотрон” производства компании Biokom. Выращивание производилось при температуре 25°С в течение 10 дней.

Варианты исследований

№	Вода	Инд. Апоптоза	Fus. oxysporum.	Mg2+ (10-3 моль/л)	Mg 2+ (10-4 моль/л)
1	+	-	-	-	-
2	+	-	-	+	-
3	+	-	-	-	+
4	+	+	-	-	-
5	+	+	-	+	-
6	+	+	-	-	+
7	+	-	+	-	-
8	+	-	+	+	-
9	+	-	+	-	+

Для определения активности каталазы была использована модифицированная методика, основанная на измерении объема выделившегося кислорода после прибавления к водному экстракту каталазы перекиси водорода. Объем выделившегося кислорода регистрировали с 3-ей по 15-ю минуту после начала реакции с интервалом 3 мин. Затем выстраивали кинетические кривые зависимости объема выделившегося O₂ от времени и аппроксимировали их функцией вида y = a ⋅ ln(x)+ b . В качестве исходного показателя активности каталазы использовали предлогарифмический коэффициент a (расчет методом дифференциального анализа кинетических кривых). Затем коэффициент a делили на массу навески, получая, таким образом, приведенный предлогарифмический коэффициент, являющийся окончательным показателем активности каталазы. Для расчета результатов анализа активности каталазы по волюмометрическим данным Гринблат А.И. была разработана компьютерная программа “Каталазоинформер”, позволяющая осуществлять групповой ввод данных, аппроксимацию, спрямление и множественный анализ кинетических кривых, т.е. осуществлять администрирование биохимических данных [1]. Внешний вид окон программного комплекса представлен на рисунок 1.

б)

Рисунок 1 – Внешний вид окон программного комплекса: а) окно ввода данных программы “Каталазоинформер”; б) окно вывода и экспорта результатов расчета программы “Каталазоинформер”

ПЦР-анализ состояния ДНК производился с помощью набора реагентов и методики, разработанных предприятием Biokom. Методика выделения ДНК базируется на извлечении ДНК сорбентом NucleOS из продуктов обработки пробы лизисным реагентом, в дальнейшем NucleOS промывается солевым буфером и ДНК десорбируется и переводится в раствор реагентом ExtraGene. ДНК, растворенная в ExtraGene, подвергается электрофоретическому разделению. Электрофорез осуществляют на агарозном геле (1,5% раствор агарозы в воде) в TBE-буфере с добавлением бромистого этидия. Фотографии гелевой пластины получают на ультрафиолетовом трансиллюминаторе (Biokom), используя способность комплекса бромистого этидия с ДНК светиться в ультрафиолетовом свете.

Результаты их обсуждение

Полученная на основе аналитических методик с использованием теории графов и математического моделирования динамика активности каталазы показала корреляционную зависимость устойчивости и проявлений апоптоза под влиянием обработки иммунокорректирующих средств. В процессе нормального развития растений гороха происходит понижение активности каталазы, свидетельствующее о детоксикации активного кислородного радикала, катализируя образование Н 2 О 2 из супероксида (рис.2).

сутки

□ здоровы е       и инф ицированны й

Рисунок 2 – Динамика активности каталазы растений гороха сорта Смарагд

При заражении растений гороха Fusarium oxysporum происходит повышение активности фермента каталазы. Это свидетельствует об увеличении необходимости должного уровня каталазной антипероксидной защиты в процессе роста растений гороха. Общая мощность системы естественных наномашин, обеспечивающих антиоксидантную защиту, возрастает, в связи с тем, что в процессе нормальной жизнедеятельности – роста и развития листа гороха, активные формы кислорода накапливаются с возрастающей скоростью и требуют адекватного ответа системы антиоксидантов.

Для коррекции иммунодефицитных состояний растений гороха были проведены опытные обработки магнийсодержащим препаратом в концентрации ионов Mg 2+ 10-3 моль/л иMg 2+ 10-4 моль/л.

Полученные данные представлены на графиках рисунков 3,4.

Анализ показал снижение активности каталазы под влиянием магния как здоровых, так и инфицированных растений к десятым суткам, что свидетельствует о восстановлении жизнеспособности гороха.

Динамика активности каталазы при апоптозе резко отличается от варианта в норме (рис.5).

и1    2    5 3 сутки

Рисунок 3 – Динамика активности каталазы растений гороха сорта Смарагд под влиянием иммунокорректора :

1 – контроль ( вода ); 2 – Mg ²⁺ (10^-3 моль / л );

3 – Mg ²⁺ (10^-4 моль / л )

□1 Z2   5 3 сутки

Рисунок 4 – Динамика активности каталазы растений гороха сорта Смарагд под влиянием иммунокорректора : 1 – контроль (Fusarium oxysporum); 2 – Mg ²⁺ (10^-3 моль / л ); 3 – Mg ²⁺ (10^-4 моль / л )

О1й2 S 3 сутки

Рисунок 5 – Динамика активности каталазы растений гороха сорта Смарагд под влиянием иммунокорректора : 1 – контроль ( индуктор апоптоза ); 2 – Mg ²⁺ (10^-3 моль / л );

3 – Mg ²⁺ (10^-4 моль / л )

В случае проявления апоптоза под влиянием магнийсодержащего препарата активность каталазы повышается к десятым суткам, так как снижается скорость накопления активных форм кислорода в клетках и происходит сбой последовательности матричного синтеза ферментов с разрушением ДНК и белков.

Для подтверждения структурно-функциональных изменений в клетках растений был проведен анализ ДНК.

По электофореграмме и темпорально рассчитанным линейным профилям можно наблюдать типичную для апоптоза картину – лестницеобразные пятна на электрофорегамме, связанные с апоптотической формой деградации ДНК и хроматина. На линейных профилях видно волнообразное искажение нисходящей ветви главного пика, являющееся следствием суперпозиции главного и группы малых пиков, появляющейся только в случае лестницеобразных электрофореграмм (рис.6).

На линейном профиле рисунка 7 показано действие магнийсодержащего препарата в концентрации ионов Mg 2+ 10-4 моль/л на индуцированный апоптоз. Как видно из графика, лестницеобразных пиков, характерных для апоптоза, не наблюдается.

Рисунок 6 – Линейный профиль электрофореграмм ДНК Рисунок 7 – Линейный профиль электрофореграмм ДНК индуктора апоптоза                 растений гороха, обработанных опытными препаратами

Таким образом, интегрирование биохимических и кибернетических методов обеспечивает точность и достоверность изучаемых явлений апоптоза.

Выводы

• 1.    Разработан и проведен высокотехнологический анализ биохимических параметров растений гороха, выявляющий структурные изменения в ДНК.

• 2.    Магний, содержащий препарат, способствует восстановлению жизнеспособности растений гороха, регулируя процессы апоптоза.