Инновационный подход к применению белковых компонентов в биотехнологии

Одной из приоритетных задач биотехнологии является обеспечение сельскохозяйственного произ водства дешевыми , экологически чистыми и эффек тивными препаратами для обработки посевного ма териала , гарантирующие формирование высоких и стабильных урожаев .

Использование белковых компонентов в биотех нологии открывает большие перспективы . Совре менное производство лекарственных препаратов , продуктов питания , растениеводство и животновод ство невозможно представить без разнообразных биотехнологических продуктов . Именно развивая биотехнологические производства , можно добиться серьезного технологического прорыва во многих отраслях народного хозяйства . Это давно поняли во развитых странах , где развитие биотехнологии стало одним из главных приоритетов в политике госу дарств [4].

С целью выявления дополнительного источника биологически активных веществ многие ученые ми ра занимаются биоскринингом растений . Фасоль является одним из таких объектов . По химическому составу семена фасоли уникальны и включены в группу важных продуктов , обеспечивающих насе ление полноценным белком . Однако белковый ком плекс фасоли содержит ряд токсичных и антиали - ментарных факторов питания , блокирующих актив ность пищеварительных ферментов , которые , воз можно , принимают участие в защитных механизмах растения . Наличие антипитательных веществ ( ин гибиторов гидролаз , лектинов и цианогенных глико зидов ) с высокой активностью в семенах фасоли делает ее перспективной с точки зрения биотехно логической переработки и получения фитопрепара тов [5].

Уникальные свойства лектинов обуславливают их успешное и широкое применение в качестве аф финных адсорбентов различных гликоконьюгатов для выделения клеток и органелл , а также в качестве специфических зондов , сыгравших значительную роль в установлении топографии мембранных угле водов . Обнаружено также , что лектины могут обла дать гормональным действием , вызывать пролифи - рацию клеток и оказывать другие физиологические эффекты [9].

Лектины и ферменты , вернее их доменные цен тры , выступают в качестве чувствительных биосен серов , детектирующих определение углеводной по следовательности в олигосахаридах , которые явля ются специфическими лигандами в углеводно белковом взаимодействии . В настоящее время большое внимание обращено не на специфические 36

функции лектинов , а на их неспецифическую роль в устойчивости растений к патогенам [4].

Лектины могут стать ценными биохимическими реагентами , использование которых получает свое развитие в экспериментальной цитохимии , диагно стике некоторых заболеваний и в биотехнологиче ских процессах выделения сложных углеводсодер жащих веществ . В последние годы делаются попыт ки использования лектинов в качестве лекарствен ных препаратов [7].

Лектины функционируют как антитела и проти востоят почвенным бактериям ; они играют ключе вую роль в развитии и дифференциации эмбрио нальных клеток , могут быть медиаторами в опреде ленных отношениях между азотфиксирующими бактериями и растением – хозяином [3]

Лектины играют роль не только в самом расте нии , но и связываться с гликоконьюгатами других организмов , внося вклад , в частности , в функциони рование симбиозов . По мнению Л . П . Антонюк и В . В Игнатова [1], агглютинин зародышей пшеницы ( АЗП ), обнаруживаемый в том числе и в корнях , инфицированных бактериями А .brasilense Sp 245, является сигнальной молекулой , изменяющей мета болизм микроорганизма в направлении , благопри ятном для роста и развития растений [1,10].

Лектин гороха в концентрации 50 мкг / мг стиму лирует рост бактерий , а на высоком азотном фоне теряет такую способность . Л . В . Косенко и др . [6] связывают это с нарушением лектин - углеводной системы узнавания бобово - ризобиальных симбио - нов из - за синтеза бактериями на высоком азотном фоне модифицированного комплекса клеточных и внеклеточных полисахаридов .

Генная инженерия использует растительные ин гибиторы протеиназ для получения устойчивых к насекомым трансгенных растений : вигна , батат , картофель , соя , рис .

В настоящее время белковые ингибиторы раз личного происхождения находят все более широкое применение в медицине . Их используют для лече ния патологических процессов , связанных с чрез мерной активацией протеолитических ферментов организма . Положительный эффект дает примене ние ингибиторов при различных воспалительных процессах , оперативных вмешательствах , травмах . Наибольшее признание получило использование ингибиторов протеиназ в терапии острых панкреа титов , а также при нарушении процессов гемоста - за [3].

Некоторые из ингибиторов обладают высокой устойчивостью к нагреванию и к действию пепсина . Инактивация наблюдается только при автоклавиро вании муки . Неактивированные ингибиторы прак тически полностью тормозят активность трипсина , в то же время инактивация ингибиторов приводит к сильному увеличению протеолиза белков .

Ингибиторы трипсина и химотрипсина, присутствующие в семенах растений, способны подавлять активность экзогенных протеиназ фитопатогенных микроорганизмов (2). Однако они могут действовать и на другие протеиназы, выполняющие регуляторные функции в растительном организме. Это позволяет предположить, что ингибиторы протеолитических ферментов играют активную роль в защите растений от поражения фитопатогенными микроорганизмами. Подтверждение этому служит подавление роста мицелия грибов рода Fusarium и B. cinerea при внесении в среду препаратом ингибитора трипсина из фасоли. Некоторые из ингибиторов отличаются особенно высокой специфичностью. Так, из семян фасоли выделен ингибитор, действующий на сериновую протеиназу фитопатогенного гриба Colletotrichum tindemuthianum, возбудителя антрактоза. Ингибитор был не активен не только по отношению к трипсину и химотрипсину, но и не действовал на сериновую протеиназу гриба Asp. Oryzae [7].

Описанные свойства лектинов и ингибиторов делают перспективным использование их в различ ных отраслях биотехнологического производства .

Поэтому задачей наших исследований является выделение белков и испытание их биологической активности , с целью создания биопрепаратов нового поколения , действие которых основано на иммуно коррекции антиоксидантной системы растений , в частности гороха .

М атериалы и методы исследования

Объектом исследования служил горох сортов Норд и Вега . Выделение лектинов из семян фасоли проводили по методу Г . Я . Алексидзе и др . [8] с из менениями , адаптированными для семян фасоли . В основе метода выделения и очистки ингибиторов протеиназ лежит методика , разработанная И . О . Мельниковой [8], адаптированная к фасоли . Испы тания биологической активности : катаклазы - метод в модификации А . И . Ермакова [8] основан на изме рении объема выделевшегося кислорода после при бавления к водному экстракту каталазы перекиси водорода ; пероксидазы - спектрофотомктрический метод [8] основан на измерении оптической плотно сти продуктов реакции , образовавшихся при окис лении гваякола за определенный промежуток вре мени .

Семена гороха замачивали перед посевом на 4 часа в летиносодержащих и ингибиторосодержащих препаратах , котроль вода и промышленные препа раты Эпин и Нарцисс .

Результаты и их обсуждение

По результатам наших испытаний на биологиче скую активность белковых компонентов , в частно сти лектинов , из семян фасоли выявлено , что лекти ны стимулировали ростовые процессы гороха и по вышали ферментативную активность клеток , отве чающую за иммунитет .

На протяжении роста проростков гороха отмечалось увеличение активности пероксидазы, и снижение активности каталазы. При этом наиболее высокая активность пероксидазы в тканях растений от- мечена при обработке раствором лектина фасоли более высокой степени разведения - 10-7% (рис. 1,2).

□ необработ анные

@ Эпин

□ Лектин фасоли 10-2%

□ Лектин фасоли 10-7%

Рисунок 1 – Активность пероксидазы в проростках гороха

4 сутки 5 сутки 6 сутки 7 сутки

□ необработанные

E Эпин аЛектин фасоли 10-2%

□Лектин фасоли 10-7%

Рисунок 2 – Активность каталазы в проростках гороха

На горохе сорта Норд в полевых условиях про водились испытания комплексных препаратов , созданных на основе лектинов фасоли . Обработка семян гороха препаратами повышает устойчи вость растений гороха к аскохитозу на 16 %, сни жает развитие корневых гнилей на 10 %, повышает урожайность на 16…23 %. Механизм действия предлагаемого препарата заключается в том , что он вызывает экспрессию генов , ответственных за иммунитет и активизирует ферменты и реакции необходимые для синтеза хлорофилла в световой реакции фотосинтеза .

Предлагаемый препарат для предпосевной об работки семян гороха , названный нами « ЛЕЛЬ » ( заявка на изобретение № 2006111695 от 10.04.06) увеличивает энергию прорастания , всхожесть се мян , уменьшает зараженность семян болезнями и вредителями , вследствии чего повышается уро жайность гороха до 12% ( табл .1).

Изучение влияния препарата , созданного на основе ингибиторов повышает болезнеустойчи вость гороха к возбудителю корневых гнилей Fusarium oxysporum, определяемого по пероксида зозависимому иммунитету в 1,5…1,8 раз по срав нению с контролем ( табл 2).

Таблица 1 – Влияние биопрепаратов на посевные качества семян и зараженность гороха сорта Вега

Препарат	Энер гия про рас - тания	Всхожесть ,%		Зара жен - ность семян
		Лабо - ратор - ная	По левая
Контроль ( вода )	86,6	84,8	85,8	33,3
Контроль ( Нацисс ,1 л / т )	87,5	91,3	91,5	9,6
Лель ,10-4%	88,5	84,1	84,8	34,9
Лель . 10-5%	87,0	93,2	91,1	29,0

Таблица 2 – Активность пероксидазы в проростках гороха , ( у . е .)

Варианты	Здоровые	Инфици рованные	(Fusfrium oxyspo-rum)
	Через сутки	Через сутки	Через 7 суток
Контроль	74,5	71,3	100,3
Ингибиторы 10 -3 %	93,5	100,0	187,0
Ингибиторы 10 -4 %	81,7	75,0	150,0

Установлено , что данный препарат повышает ус тойчивость гороха к бледнопятнистому аскохитозу на 16 %, снижают поражение семян гороховой пло дожоркой на 12%, увеличивают урожай семян на 20 %.

Выводы

Лектины фасоли стимулируют повышение им мунной системы растений гороха . Показателем это го является повышение напряженности фермента тивных реакций в организме растений .

Обработка семян гороха лектинсодержащими препаратами повышает устойчивость растений го роха к аскохитозу на 16 %, снижает развитие корне вых гнилей на 10 %, повышает урожайность на 16…23 %.

Предлагаемый препарат « Лель » для предпосев ной обработки семян увеличивает энергию прорас тания , всхожесть семян , уменьшает зараженность семян болезнями и вредителями .

Обработка препаратом , созданным на основе ин гибиторов протеиназ повышает болезнеустойчи вость гороха к возбудителю корневых гнилей Fusarium oxysporum в 1,5…1,8.

Таким образом , необходимость дальнейших ис пытаний компонентов белкового комплекса семян фасоли для создания фитоиммуномодуляторов дик туется тем , что имеющийся большой перечень пре паратов подобного действия не распространяется на бобовые культуры , в частности горох . Вместе с тем , созданные нами препараты на основе природных компонентов , экологически безопасны и могут за менить химические средства защиты .