Инсектицидные и полифункциональные штаммы Bacillusthuringiensis: мировая практика и разработки ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (обзор)

Потенциальные потери урожая сельскохозяйственной продукции от вредных организмов в мире, по данным ФАО, составляют 36 %, в том числе

14 % от вредителей и 12 % от болезней (1). Из-за потерь урожая от вредителей и болезней в сочетании с потребностью в экологически чистой продукции актуально использование микробиологических препаратов, поскольку оно позволяет существенно уменьшить нагрузку на агробиоценозы, возникающую в результате применения химических пестицидов.

В настоящее время актуально изучение различных аспектов взаимодействий между микроорганизмами и растениями, в особенности обеспечивающих защиту сельскохозяйственных культур от вредителей — фитофагов и патогенов. Одно из приоритетных направлений использования биотехнологий в растениеводстве и земледелии — применение биопрепаратов на основе микроорганизмов, способных выполнять фитозащитные функции.

Цель настоящего обзора — рассмотрение и сравнительный анализ наиболее перспективных для создания биопрепаратов бактерий рода Bacillus , обладающих патогенными свойствами в отношении вредных насекомых-фитофагов и фитопатогенов.

Доминирующая роль принадлежит биопрепаратам, созданным на основе спорообразующих аэробных бактерий Bacillus thuringiensis Berliner (Вt), которые широко используются в качестве перспективного и безопасного энтомоцидного средства. Пестициды на основе Bt составляют до 75 % мирового рынка продаж биоинсектицидов и около 4 % от всех инсектицидов (2). Коммерческие микробиологические биопрепараты для защиты сельскохозяйственных растений от насекомых вредителей создаются на основе Bacillus subsp. thuringiensis , kurstaki , aizawai , tenebrionis (3-5), для защиты от кровососущих двукрылых — на основе Bacillus subsp. israelensis (6).

Бактерии Bt по масштабам применения занимают первое место в мире на рынке биопестицидов (7). Эта бактерия была описана более 100 лет назад. Еще в 1902 году японский исследователь Shigetane Ishiwata, изучая болезни тутового шелкопряда, сделал подробное описание болезни и самого микроорганизма, назвав его Bacillus sotto . Позднее, в 1915 году, E. Berliner в Тюрингии выделил и изучил аналогичную спорообразующую бактерию из больных гусениц мельничной огневки Ephestia kuhniella Zell., предложив назвать этот микроорганизм Bacillus thuringiensis Berliner (8, 9). Позднее у Bt были обнаружены параспоральные белковые кристаллы, обладающие инсектицидными свойствами (10). На основе этого микроорганизма в дальнейшем стали разрабатывать средства защиты растений.

В 1962 году в классической работе H. de Barjac и A. Bonnefoi (11) была предложена серологическая классификация Bt по флагеллярному Н-антигену. В 1985 году на основании физиолого-биохимических свойств различных вариантов Bt, охарактеризованных на тот период, O. Lysenko (12) уточнил схему серологической классификации, которая наиболее распространена в настоящее время.

На современном этапе Bt можно идентифицировать с использованием молекулярно-генетических методов на основе показателей сходства последовательностей некоторых консервативных генов, а также наличия или отсутствия плазмид, несущих детерминанты вирулентности (13, 14). Эти подходы расширяют возможности контроля чистоты препаратов, созданных на основе активных и технологичных штаммов, а также позволяют выявлять микроорганизмы в окружающей среде без их культивирования. Описано около 100 подвидов и серовариантов, включающих около 50000 штаммов Bt (15). Эти бактерии очень жизнеспособны и занимают различные экологические ниши. Они длительно сохраняются в различных субстратах среды обитания насекомых (почве, воде, ветках, трупах насекомых и др.) и при определенных условиях могут быть источником спонтанных инфекций и вызывать эпизоотии у последующих поколений насекомых (16).

Бактерии Bacillus способны переживать неблагоприятные условия за счет способности образовывать споры. В спорах бактерий накапливаются биологически активные вещества, действие которых усиливается при прорастании (17, 18). На сегодняшний день среди бактерий Bt выделено более 80 сероваров, обладающих инсектицидной активностью против насекомых различных таксономических групп, преимущественно против вредителей из отрядов Lepidoptera , Heminoptera , Diptera , Coleoptera . Они широко используются в производстве биологических пестицидов и генетически модифицированных растений. Бактерии Bt , кроме инсектицидных, обладают антибактериальными и фунгицидными свойствами (19, 20), активны против нематод (21-23), клещей (24-26), моллюсков (27), способны стимулировать рост растений (28, 29), а также продуцировать разнообразные белковые элиситоры, способные активировать природные защитные реакции растений на воздействие вредных организмов. Они усиливают синтез метаболитов, которые снижают повреждаемость и повышают устойчивость растений к вредителям, болезням и стрессовым факторам окружающей среды (30).

Бактерии Bt в целом эффективны и специфичны в отношении целевых объектов, безопасны для окружающей среды (31-33). Однако в литературе есть сведения о том, что прямое воздействие Bt на целевые объекты может косвенно влиять на другие микроорганизмы в пищевой цепи. Кроме того, они могут оказывать нецелевое действие на различных почвенных и наземных беспозвоночных, что расширяет их влияние — до позвоночных, включая человека. Даже при отсутствии прямого вредного воздействия Bt может проявляться отрицательное действие на нецелевые объекты, например через снижение кормовой базы и ее питательной ценности. В связи с огромной фенотипической пластичностью штаммов Bt и сложностью экологических взаимоотношений, в которые они вступают, оценка безопасности пестицидов должна учитывать множество уровней организации экосистем и распространяться на широкий спектр их обитателей (34).

Инсектицидные эффекты. Благодаря специфичности молекулярных механизмов действия эндотоксинов Bt проявляется селективный токсический эффект этого микроорганизма в отношении некоторых представителей вредоносных насекомых. Для биоконтроля за ними наиболее широко используются препараты на основе трех патоваров. Патовар А — подвиды Bt (var. thuringiensis , var. dendrolimus , var. galleria, var. kurstaki ), кристаллы эндотоксинов которых наиболее активно действуют на чешуекрылых ( Lepidoptera ). Насчитывается более 70 видов насекомых, чувствительных к этому патоварианту. Патовар В подвид Bt (var. israelensis ) продуцирует ларвицидные компоненты, поражающие личинок кровососущих комаров и мошек, а также растительноядных комаров (рисового и шампиньонного) ( Dip-tera ). Патовар С подвиды Bt (var. tenebrionis , var. darmstadiensis , var. aizawai , var. san diego , var. kurstaki ) активны против жесткокрылых ( Coleoptera ) (7, 16, 35). Список препаратов, созданных на основе этих патоваров, представлен в таблице 1.

1. Микробиологические препараты, созданные на основе патовариантов Bacillus thuringiensis (Bt)

Препарат Bt	Патовариант	var.	Страна-разработчик
Битоксибациллин	А	thuringiensis	Россия
Дендробациллин		dendrolimus	Россия
Энтобактерин		galleria	Россия
Лепидоцид		kurstaki	Россия

Дипел	kurstaki		США
Бактоспеин		kurstaki	Франция
Бактокулицид	В	israelensis	Россия
Бактицид		israelensis	Россия
Бактимос		israelensis	Франция
Текнар		israelensis	Швейцария
Вектобак		israelensis	США
Москитур		israelensis	Чехословакия
Децимид	С	tenebrionis	Россия
Колорадо		tenebrionis	Россия
Бацитурин		darmstadiensis	Белоруссия
Бацикол		darmstadiensis	Россия
Новодор		tenebrionis	Дания

В целом насчитывается большее, чем представленное в таблице 1, число патовариантов Bt, в том числе активных в отношении фитопатогенов. Выявлен новый патовар этой бациллы — F (fungi, грибы) (36, 37). Биопре-стициды на основе Bt используются преимущественно для борьбы с насекомыми (38-40). К действию Вt восприимчивы вредители из отрядов Lepi-doptera , Coleoptera , Heminoptera , Diptera , клещи (табл. 2).

• 2.    Вредители, восприимчивые к различным сероварам Bacillus thuringiensis

  Серовар 1                    Вредители	Культуры	1 Ссылка
  Bt H 1     Чешуекрылые ( Lepidoptera ): яблонная плодожорка ( Laspeyresia	Плодовые (яблоня,	(16)
  и Bt H 10 pomonella L.), яблонная и плодовая моли ( Yponomeuta malinellus Zell., Y. padellus L.), боярышница ( Aporia crataegi L.), американская белая бабочка ( Hyphantria cunea Drury), непарный и кольчатый шелкопряд ( Ocneria dispar L. и Malacosoma neustria L.), златогузки ( Euproctis chrysorrhoea L., E. karghalica M.), боярышниковая листовертка ( Cacoecia craeganata Hb.), зимняя пяденица ( Operophtera brumata Cl)	груша, слива, абрикос) и древесные (дуб, вяз, клен) насаждения
  Капустная совка ( Mamestra brassicae L.), капустная и репная белянки ( Pieris brassicae , P . rapae L.), капустная моль ( Plutella mac-ulipennis Curt.)	Капуста	(16)
  Гроздевая листовертка ( Polychrosis botrana Schiff.)	Виноград	(16)
  Хлопковая совка ( Heliothis zea F.), озимая совка ( Scotia segetum Schiff.), карадрина ( Laphigma exigua Hb.), луговой мотылек ( Loxostege sticticalis L.)	Технические культуры (хлопок, рапс, сахарная свекла, кукруза)	(16)
  Жесткокрылые ( Coleoptera ): колорадский жук ( Leptinotarsa de-cemlineata Say), рапсовый цветоед ( Meligethes aeneus ), восточный горчичный листоед ( Colaphellus hoefti Men), крестоцветные блошки ( Phyllotreta nemorus, Ph. undulata, Ph. nigrines, Ph. vittula Redt. ), картофельная коровка ( Henosepilachna vigintioctopunctata Motschulsky)	Картофель и другие пасленовые	(16, 41)
  Землянично-малинный долгоносик ( Anthonomus rubi Hbst.)	Земляника, малина	(7)
  Гречишный долгоносик ( Rhinoncus sibiricus Faust.)	Гречиха	(42)
  Соевый полосатый листоед ( Medythia nigrobilineatus Motsch.)	Соя	(43)
  Перепончатокрылые (Hymenoptera): бледноногий крыжовниковый пилильщик ( Pristphora pallipes Lep.), желтый крыжовниковый пилильщика ( Pteronidea ribesii Scop.), смородиновая листовертка ( Pandemis ribeana Htm.)	Крыжовник, смородина	(16)
  Равнокрылые (Homoptera): трипсы (Thysanoptera), белокрылка ( Trialeurodes vaporariorum West.)	Огурцы, томаты	(44)
  Морковная листоблошка ( Trioza apicalis Foerst)	Морковь	(45)
  Паутинный клещ ( Tetranychus urticae Koch)	Огурцы, томаты, хлопчатник	(16)
  Малинный клещ ( Eriophyes gracilis ), земляничный клещ ( Tarsonemus pallidus Banks)	Малина, земляника	…(45)
  Bt H 14    Двукрылые (Diptera): кровососущие комары (родов Anopheles, Aedes, Culex, Culiseta и др.) и мошки, а также растительноядные: рисовый ( Cricotopus silvestris F .) и шампиньонный ( Licoriella fucorum Frey) комарики	Рис, шампиньоны	(16)

Эффективность препаратов на основе Bt составляет 70-100 %. Лишь в отношении белокрылки, малинного клеща и морковной листоблошки она была ниже — 50-60 %.

Действие Вt на вредителей обусловливается энтомотоксическим, эн-томопатогенным и метатоксическим эффектами за счет наличия кристаллов эндотоксина, экзотоксина, фосфолипазы С и спор. Такой набор факторов 406

вирулентности действует в разной степени и в различных сочетаниях на насекомых разных видов. По характеру проникновения и первичного поражения Bacillus thuringiensis относится к патогенам кишечного действия. Основное место его локализации — средний отдел кишечника. Там белковый кристалл превращается в протоксин, который переходит в истинный токсин под действием сериновых протеаз. Это приводит к возникновению патологических процессов, сопровождаемых септицемией — сильным поражением, при котором гемолимфа и ее фагоцитарные и неспецифические механизмы иммунитета уже не в состоянии подавлять размножение беспрерывно проникающих в нее микроорганизмов. Происходит разрыв клеток пораженных тканей, и микроорганизмы колонизируют кровеносную систему насекомого, вызывая его гибель (16).

Bt - инсектициды содержат споры и вырабатываемые в стационарную фазу инсектицидные белковые кристаллические параспоральные токсины Cry и цитолитические Cyt-белки, обнаруженные у диптеро-специфичных штаммов ( B. thuringiensis subsp. israelensis ) (46-48). Cry и Cyt-белки относятся к классу PFT-токсинов (pore-forming toxins), образующих поры в клеточных мембранах. При активации Cyt-белков с токсинами Cry они выступать в роли синергистов, что повышает эффективность действия (16, 49). В период вегетативного роста некоторые штаммы Bt секретируют растворимые инсектицидные токсины семейств Vip и Sip, активные в том числе против некоторых жуков, а также Vip3, активные против чешуекрылых насекомых (50-52).

До 1998 года классификация дельта-эндотоксинов опиралась на специфичность их действия. Согласно этой классификации, Cry-белки распределяются на основе их спектра активности и молекулярной массы. Селективное токсическое действие δ -эндотоксина проявляется на отдельных представителях отрядов насекомых. Так, Cry 1 и Cry 2 токсичны для Lepidoptera , Diptera ; Cry 3 — для Ñoleoptera ; Cry 4 — только для Diptera (47, 53), против нематод активны Cry 5, Сry 6, Сry 55 (54, 55).

Активность токсинов усиливается за счет минорных факторов виру-летности белковой природы, к числу которых относятся ферменты хитиназы, лецитиназы, протеазы, гиалорунидазы, гиалуронидазы фосфатазы, целлюлазы, металлопротеазы и др. (56-58), а также вторичные метаболиты, включающие аминополиоловые антибиотики и экзотоксины. Так, некоторые из Bt ( thuringiensis , alesti , dendrolimus , sotto , galleriae , morissoni , ostrinae , tolworthi , darmstadiensis ) образуют термостабильный водорастворимый β -эк-зотоксин (турингиензин) нуклеотидной природы (16, 59), который усиливает энтомоцидный эффект спорокристаллического комплекса и позволяет модифицировать его действие (60).

Установлено, что β -экзотоксин представляет собой ингибитор ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Это небольшая молекула олигосахарида, в состав которой входят аденозин, глюкоза, фосфорная глюконовая кислота с молекулярной массой 701 Да (61). Благодаря β -экзотоксину происходит те-ратогинез, который в более сильной степени проявляется у взрослых насекомых. Он действует медленнее и может проникать не только через кишечник, но и через покровы насекомых. В комплексе со спорами и кристаллами β -экзотоксин проявляет себя как синергист. После разрушения стенки кишечника эндотоксин быстрее проникает в гемолимфу и органы насекомого, вызывая физиологические изменения и летальный эффект.

Экзотоксинсодержащие препараты были ранее рекомендованы не только против гусениц, но и таких вредителей, как колорадский жук Lep- tinotarsa decemlineata Say и паутинный клещ Tetranichus urtica Koch. (62). Однако в последнее время β-экзотоксин считают токсичным почти для всех организмов, включая человека, из-за способности ингибировать активность РНК-полимеразы — фермента, обеспечивающего транскрипцию (матричный синтез РНК). На токсичность турингиезина для легочных тканей крыс указывают Z. Xu с соавт. (63). Для того чтобы применение Bt с инсектицидными свойствами оставалось безопасным и нецелевые организмы не пострадали, у новых штаммов Bt должен отсутствовать экзотоксин. В Европе, США и Канаде необходимым требованием для производства препаратов является отсутствие β-экзотоксина (64-66).

О собенности антифунгальных эффектов. Некоторые штаммы Bt, наряду с инсектицидными, проявляют антифунгальные свойства (67-69). Механизм антифунгального действия Вt связан с рядом факторов. Бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду литические ферменты, в частности протеазы и хитиназы, которые лизируют клеточные стенки фитопатогенных грибов. При лизисе содержимое гиф гриба становится источником питания и энергии для бацилл (70-72). Bt продуцируют липопептиды сурфактины, фенгицины и итурины, которые усиливают ан-тифунгальную активность (73-75).

• D. Miljakovic соавт. (76) показали, что сурфактин усиливает системную устойчивость к болезням у фасоли, томатов, табака и винограда. Фен-гицин индуцировал защитный эффект у картофеля, томатов, табака (77). Значительное внимание уделяется исследованиям, посвященным образованию бактериями рода Bacillus липопептидных циклических антибиотиков, отвечающих за антагонистический эффект (78-80).

В литературе имеются сведения, указывающие на связь антибиотической активности со спорокристаллическим комплексом, в том числе с δ -эндотоксином. Так, ряд авторов предполагают, что антифунгальный эффект B. thuringiensis обусловлен разобщением окислительного фосфорилирования и дыхания у объектов (81-83). В спорах бактерий, благодаря которым они имеют возможность переживать неблагоприятные условия, накапливаются биологически активные вещества. В момент прорастания антагонистическая способность бактерий резко увеличивается. В состав жидких препаратов на основе Bt входит спорокристаллический комплекс и экзотоксин. В лабораторных исследованиях было установлено, что именно спорокристаллический комплекс обладает наибольшей ингибирующей активностью по отношению к грибу Botrytis cinerea по сравнению с экзотоксином. Его активность была в 6 раз выше (90,3 %), чем у экзотоксина (15,1 %) (86). При автоклавировании спорокристаллического комплекса отмечено резкое снижение антифунгальной активности, что свидетельствует о его ответственности за ингибирование роста гриба (85).

Бактерицидные свойства. Бактерии Bt, наряду с инсектицидными свойствами, обладают и бактерицидными. Они подавляют бактерии родов Agrobacterium , Erwinia , Xanthomonas , Pseudomonas , Clavibacter , Ralstonia (68, 86, 87). Штаммы Bt продуцируют бактериоцины, такие как энтомоцин 9 (88) и энтомоцин 110, способные ингибировать рост некоторых грампо-ложительных бактерий — Listeria monocytogenes , Paenibacillus и видов Bacillus (89), бактурицин F 4 (90), турицин 17 (91), который также обладает ростостимулирующим свойством (92) и другие. Антибактериальное действие осуществляется за счет способности синтезировать липопептидные антибиотики фенгицины, сурфактины и итурины. Причем наибольшую активность проявляет сурфактин (93). Некоторые из инсектицидных токсинов, такие как Cyt1Aa, также обладали бактерицидными свойствами в отношении

Escherichia coli и бактериостатическими в отношении Staphylococcus aureus (94). В Индии из лекарственного растения андрографиса метельчатого ( And-rographis paniculata Nees.) был выделен эндофитный штамм B. thuringiensis KLI, который обладал высокой антимикробной активностью за счет образования фенгицин-подобного липопептида (95).

Ф иторегуляторная активность . У бактерий Bt обнаружена ростостимулирующая активность в отношении растений (plant growth promoting activity, PGPB) (29, 80, 96). Бактерии стимулируют рост растений благодаря антагонистической активности по отношению к фитопатогенам, за счет активации растворения фосфатов и усиления поглощения минеральных веществ, а также за счет образования фитогормонов (97). Обработка Bt приводит к стимуляции роста и усиливает устойчивость к болезням. Некоторые авторы предполагают, что за стимуляцию роста растений бактериями отвечают ауксины, суфрактины и другие метаболиты (98). Ростостимулирующее действие может осуществляться за счет продукции индолилуксусной кислоты, сидерофоров. фитазы, литического фермента оксалатоксидазы. Штаммы PGPB синтезируют сидерофоры и колонизируют ризосферу, тем самым повышая доступность железа. Они стимулируют рост и развитие растений, способствуя усвоению железа растениями, особенно в условиях его дефицита (99).

Иммунорегуляторная элиситорная активность. Одно из направлений биоконтроля основано на активации элиситорными молекулами естественных защитных механизмов растений, которая происходит при их взаимодействии с вредными объектами и приводит к индуцированной устойчивости. Элиситоры образуются в ответ на стрессовые факторы (повреждения или внедрение патогена). Они повышают устойчивость к бактериальным, грибным, вирусным патогенам, а также к растительноядным насекомым (100). Большинство элиситоров представляют собой белки и пептиды, глипопептиды, липиды и гликозиды. В качестве биотических элиситоров используют комплексные неочищенные биологические препараты и композиции: экстракты дрожжей, препараты культур грибов, бактерий или их клеточных стенок. Наиболее известные элиситоры — хитин и хитозан. Элиситоры, как правило, не обладают прямой биоцидной активностью, а действуют как сигнальные вещества непосредственно на растения, активируя защитные механизмы, и тем самым помогают растениям справляться с инфекцией или вредителями с помощью собственных метаболитов (101).

За защитный эффект против фитопатогенов у многих микробных биоагентов (включая штаммы Bacillus ) отвечают антимикробные пептиды, нарушающие метаболизм патогена. Они ингибируют биосинтез нуклеиновых кислот и белков, подавляют активность ферментов или дезинтегрируют клеточные мембраны (30). Многие препараты на основе элиситоров обладают полифункциональными свойствами, способствуют снижению зараженности, стимулируют рост растений и повышают урожай. Использование элиситоров в технологиях защиты растений имеет большой потенциал для экологизации растениеводства.

Таким образам, бактерии Bt обладают полифункциональными свойствами, сочетающими энтомоцидный, антифунгальный и фиторегулятор-ный эффекты, и могут использоваться для создания препаратов с комплексным действием. Перспективным направлением представляется селекция новых штаммов с полифункциональными свойствами с последующим детальным анализом их геномов на предмет наличия генов, определяющих хозяйственно ценные свойства. Такие исследования в настоящее время ведутся, в том числе с использованием инновационных биоинформатических инструментов для выявления в геномах штаммов генов, кодирующих инсектицидные белки (102, 103).

Разработки препаратов на основе Bt во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ФГБНУ ВНИИСХМ). В институте были получены инсектицидные штаммы бактерий Bt разных серотипов, предназначенные для разработки микробиологических препаратов для борьбы с вредителями-фитофагами. Эти штаммы депонированы в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (ВКСМ) ФГБНУ ВНИИСХМ. На их основе в 19701990 годах под руководством Н.В. Кандыбина с активным участием ряда сотрудников, включая Н.М. Барбашову, А.Я. Лескову, О.В. Смирнова, В.П. Ермолову, С.Д. Гришечкину, была создана линейка биопрепаратов. битоксибациллин — первый микробиологический препарат на основе Bacillus thuringiensis var. thuringiensis (BtH 1 ), выделенного из мертвых особей кольчатого шелкопряда в Крыму, проявил эффективность против чешуекрылых, жуков, некоторых двукрылых, перепончатокрылых и клещей. Бактокулицид — ларвицидный препарат на основе B. thuringiensis var. israelen-sis (BtH 14 ), выделенного из аедогенных водоемов, предназначен для борьбы с кровососущими двукрылыми (комары и мошки), рисовым и шампиньонным комариками. Бацикол на основе B. thuringiensis var. darmstadiensis (BtH 10 ), обладающий селективным действием в отношении опасных жесткокрылых насекомых-вредителей, включая имаго, предназначен для применения на картофеле, овощных, ягодных и других культурах. Штаммы var. thuringiensis и var. darmstadiensis продуцируют и эндотоксин, и β -экзотоксин, за счет чего препараты, полученные на их основе, по назначению и эффективности имеют сходную инсектицидную активность (16). Эффективность штаммов var. israelensis обусловлена действием кристаллического эндотоксина, вызывающего у личинок комаров деструктивные изменения стенки кишечника, особенно его среднего отдела. К его действию наиболее чувствительны личинки комаров родов Aedes и Culex , менее чувствительны личинки рода Anopheles (16).

В ФГБНУ ВНИИСХМ проводится поиск, выделение, описание культурально-морфологических, физиолого-биохимических свойств Bt. В настоящее время ведутся масштабные работы по выявлению новых штаммов, изучению их геномов (39, 104), анализу свойств бацилл Bt и их биотестированию. На основе новых штаммов разрабатываются прототипы биопрепаратов. В результате проведенных исследований собрана коллекция новых эффективных штаммов BtH 1 , BtH 10 , BtH 14 (всего более 30 штаммов), описан новый вид Bacillus altaicus (105). В результате были отобраны штаммы BtH 1 800/15, BtH 10 56, BtH 14 7-1/23А (табл. 3).

3. Культурально-морфологические признаки штаммов Âacillus thuringiensis из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ

Признак	Штамм
	BtH 1 800/15	BtH 10 56	\     BtH 14 7-1/23А
Окрашивание по Граму Форма и размер вегетативных клеток Подвижность Соединение клеток Образование спор Форма и размер спор	Грамположительные     Грамположительные     Грамположительные Морфология клеток Ровные или слегка извили-Палочковидные,         Ровные или слегка изогну- стые палочки, 2,5-3,0 ½ 0,8- 1,2-1,5½2,5-4,5 мкм      тые палочки, 2,9-3,8½0,9- 0,9 мкм                                            1,1 мкм Перитрихиальное жгутико-Перитрихиальное жгути- Перитрихиальное жгутико-вание                   кование                вание Короткие цепочки       Единичные или короткие Короткие и длинные це- цепочки               почки Субтерминальное        Субтерминальное       Субтерминальное Овальные, 0,8-0,9½1,1-    Овальные, 0,8-1,4 мкм   Эллиптические, диаметр 1,3 мкм                                               0,9-1,1 мкм

Форма и размер кристал- Правильная ромбовидная Тетрагональная, бипира- Неправильная, от 0,4-0,5

лического белкового эндотоксина

с четкими гранями, 1,2-   мидальная или овоидная, до 1,2-1,4 мкм 4,5½0,5-2,3 мкм           0,2-0,6 0,3-0,8 мкм Морфология колоний на МПА

Диаметр Поверхность Профиль оптические свойства окраска колоний окраска субстрата Край Структура Консистенция

0,8-1,5 см                 0,4-0,8 см                 0,8-1,2 см Мелкошероховатые      Шероховатые          Мелкошероховатые Плоские               Плоские               Плоские Матовые               Непрозрачные, матовые Матовые Серо-белые              Серовато-белые         Серовато-белые Не изменяется           Не изменяется          Не изменяется Неровный             Неровный            Волнистый Мелкозернистая         Мелкозернистая        Мелкозернистая Мягкая                Мягкая               Вязкая

Чистые культуры Bt растут аэробно на плотных питательных средах: мясопептонном агаре (МПА), рыбном агаре (РА), картофельном агаре (КА) и других. Рост колоний и морфология клеток представлены на рисунке.

Рост колоний и морфология клеток Bacillus thuringiensis на рыбном агаре: А — Â. thuringiensis var. thuringiensis 800/15 (BtH 1 ); Б — Â. thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH 10 ); В — Â. thuringiensis var. israelensis 7-1/23А (BtH 14 ) Световая микроскопия (иммерсионный объектив ½100, микроскоп Zeiss Axio Imager A2, «Carl Zeiss AG», Германия) препаратов, окрашенных анилиновым черным («Lucar», Россия).

Штамм BtH 1 800/15, который служит основой препарата-протипа битоксибациллина, выделен из трупов личинок колорадского жука в Ленинградской области (106). Принадлежность этого штамма к Â. thuringiensis var. thuringiensis была подтверждена посредством секвенирования последовательностей, кодирующих 16S pРНК и В-субъединицу ДНК-гиразы ( gyrB ) (107). Показана высокая эффективность и широкий спектр действия препарата в полевых условиях (табл. 4) (107).

• 4.    Эффективность жидкого препарата на основе BtH 1 800/15 против вредителей-фитофагов в полевых условиях на разных культурах (2020-2022 годы) (107)

  Культура                    Вредитель	Географическая зона	БЭ, %
  Капуста ( Brassica        Капустная совка ( Barathra brassicae L.)	Ленинградская обл.	90-93
  oleracea )                 Капустная белянка ( Pieris brassicae L.)	Ленинградская обл.	94-95
  Репная белянка ( P. rapae L.)	Ленинградская обл.	85-96
  Капустная моль ( Plutella maculipennis Curt.)	Ленинградская обл.	80-90
  Картофель ( Solanum tu- Колорадский жук ( Leptinotarsa decemlineata Say) Ленинградская обл.		88-97
  berosum )                Колорадский жук ( L. decemlineata Say)	Тамбовская обл.	75-95
  Картофельная коровка ( Henosepilachna vigintioctopunctata Motschulsky)	Приморский край	79-81
  Крыжовник ( Ribes uva- Желтый крыжовниковый пилильщик crispa )                      ( Pteronidea ribesii Scop.)	Ленинградская обл.	71-73
  Огурец ( Ñucumis sativus ) Паутинный клещ ( Tetranychus urticae Koch.)	Ленинградская обл.	97-99
  Примечание. БЭ — биологическая эффективность. Диапазон представлен на основе усредненных данных.	значений эффективности	препарата

5. Эффективность препарата на основе BtH 10 56 против вредителей-фитофагов в полевых условиях на разных культурах (1994-2013 годы) (108)

Препарат-прототип бацикола был создан на основе нового штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10) 56, выделенного из трупов колорадского жука в Ленинградской области, с последующей многоступенчатой селекцией и анализом физиологических и хозяйственно ценных свойств штамма (108). Посредством секвенирования и аннотации полного генома у этого штамма выявлена инсектицидная активность, обусловленная наличием гена, кодирующего токсин Cry1Ea7, и экзотоксина, относящегося, вероятно, ко II классу. Выявление генов токсинов Cry в геномах различных штаммов может быть проведено при помощи авторской программы CryProcessor (102). Антифунгальные свойства штамма обусловлены наличием генов, кодирующих ряд синтетаз нерибосомно синтезируемых пептидов (39).

Препарат на основе BtH 10 56 предназначен для борьбы с широким кругом массовых вредителей-фитофагов и применяется на важнейших сельскохозяйственных культурах: картофеле, перце, томатах, баклажанах, крестоцветных овощных, горчице, ягодниках, зерновых и других культурах. Эффективность препарата была проверена в полевых условиях (табл. 5).

Культура	Вредитель	Географическая зона	БЭ, %
Картофель ( Solanum	Колорадский жук ( Leptinotarsa	Ленинградская обл., Тамбовская	96-100
tuberosum )	decemlineata L.)	обл., Воронежская обл.
	Картофельная коровка ( Henosepilachna	Приморский край	88-90
Крестоцветные	vigintictomaculate Motch.) Крестоцветные блошки из р. Phyllotreta	Ленинградская обл., Новосибир-	92-96
( Cruciferae ) Соя ( Glycine max )	Соевый полосатый листоед ( Medythia	ская обл. Приморский край	75,5-77,0
Гречиха ( Fagopyrum	nigrobilineatus Motsch.) Гречишный долгоносик ( Rhinoncus	Приморский край	56-60
esculentum ) Земляника ( Fragaria	sibiricus Faust) Землянично-малинный долгоносик	Ленинградская обл.	75-80
vesca ) Капуста ( Brassica	( Anthonomus rubi Hbst.) Капустная белянка ( Pieris	Ленинградская обл.	96-98
oleracea ) Морковь ( Daucus	brassica L.) Морковная листоблошка ( Trioza	Ленинградская обл.	48-50
caróta ) Цветочные культуры	apicalis Foerst.) Трипсы Thysanoptera	Ленинградская обл.	80-90

Примечание. БЭ — биологическая эффективность. Диапазон значений эффективности препарата представлен на основе усредненных данных.

Препарат показал высокую эффективность (75-100 %). Лишь в отношении морковной листоблошки она была ниже и составляла 48-50 %. Получен патент на новый штамм B. thuringiensis var. israelensis (BtH 14 ) 7-1/23А, который служит основой препарата бактокулицида (109). Штамм выделен из анофелогенного водоема в Ленинградской области. Его принадлежность к BtH 14 была подтверждена секвенированием гена, кодирующего В-субъединицу ДНК-гиразы GyrB. С помощью ПЦР-анализа выявлено наличие генов cry4 и cry11 , кодирующих белковые инсектицидные токсины (110).

Полевые испытания против кровососущих комаров родов Aedes и Anoðheles проводились в местах массового выплода в водоемах парков (г. Пушкин), комаров рода Ñulex — в подвальных помещениях, рода Ñricot-opus — в рисовых чеках в Краснодарском крае. Контролем служили необработанные участки. Через 48 ч погибло 92,8-100 % комаров Aedes aegypti , 94,8-98,4 % Anopheles maculipennis , 90,2-100 % Culex pipiens molestus , 94,997,8 % Cricotopus sylvestris.

Таким образом, препарат на основе BtH 14 7-1/23А обладал высокой ларвицидной активностью против кровососущих комаров-переносчиков опасных трансмиссивных инфекций человека. Он также оказался перспективен для применения против растительноядных двукрылых: рисового комарика Cricotopus sylvestris и грибного комарика Licoriella fucorum Frey

(эффективность 90-97,2 %) (110).

В отношении новых препаратов-прототипов была проведена оценка фиторегуляторной активности.

Препараты на основе BtH 1 800/15 и BtH 10 56 оценивались в лабораторных условиях с использованием рулонов с фильтровальной бумагой по ГОСТ 1038-84 (111). В опыте использовали семена свеклы ( Beta vulgaris L.), кабачка ( Cucurbita pe t po L.), томатов ( Solanum lycopersicum L.), огурцов ( Cucumis sativus L.) и капусты ( Brassica oleracea L.). Через 2 нед определяли всхожесть семян и измеряли длину корней и ростков (табл. 6).

• 6.    Фиторегуляторная активность препаратов ( % к контролю) на основе штаммов Bt ( n = 4, лабораторный опыт) (107, 108)

  Культура	Штамм
  	BtH 1 800/15			BtH 10 56
  	всхожесть	высота проростков	длина корней	всхожесть	высота проростков	длина корней
  Свекла ( Beta vulgaris L.)	103	104	112	109	118	120
  Кабачки ( Cucurbita pe t po L.)	123	122	119	109	114	109
  Томаты ( Solanum lycopersicum L.)	108	138	122	115	125	119
  Огурцы ( Cucumis sativus L.)	110	108	123	111	116	123
  Капуста ( Brassica oleracea L.)	105	126	123	115	115	112

• 7.    Ростостимулирующая активность препарата на основе Bacillus thuringiensis var. israelensis 7-1/23A в отношении вешенки и шампиньона ( n = 4, лабораторный опыт) (110)

В результате проведенных исследований показано отсутствие фито-токсического действия. Отмечена стимуляция всхожести семян (на 3-23 %), увеличение высоты проростков (на 4-38 %) и длины корней (на 12-23 %).

Оценку ростостимулирующей активности BtH 14 также проводили в лабораторных исследованиях на вешенке ( Pleurotus ostreatus ) и шампиньонах ( Agaricus campestris ) (табл. 7).

Рост колоний гриба на 7-е сут

Концентрация препарата в среде, %	Pleurotus ostreatus		Agaricus campestris
	диаметр, см ( M ± SEM)	к контролю, %	диаметр, см ( M ±SEM)	к контролю. %
5,0	5,3±0,25	132,5	4,5±0,25	128,2
10,0	5,0±0,50	125,0	4,2±0,20	119,7
Контроль (дрожже-полисаха-	4,0±0,55		3,5±0,20
ридная среда)

Примечание. Результаты обрабатывали методом дисперсионного анализа при доверительном интервале 95 %. Показатели, полученные в вариантах с обработкой препаратом, статически значимо (p < 0.05) отличаются от контроля.

Установлено , что препарат не подавлял рост мицелия грибов, а наоборот, усиливал их развитие. Так, внесение в среду препарата в концентрации 5 % приводило к усилению роста вешенки на 32,5 %, шампиньона — на 28,2 %. При концентрации 10 % показатели были несколько ниже (111).

Все новые препараты были изучены на антифунгальную активность in vitro в чашках Петри с использованием методов блоков (табл. 8) (112).

8. Антифунгальная активность препаратов на основе Bt (лабораторный опыт) (112)

Вид фитопатогенного гриба	Ингибирование роста колоний гриба через 5 сут, %
	BtH 1 800/15     1	BtH 10 56	1 BtH 14 7-1/23А
Botrytis cinerea Pers	45,3-53,0	89,2 -100	37,6-39,9
Pythium spp.	36,0-40,0	72,9 -80,1	26,4-30,0
Bipolaris sorokiniana (Sacc) Shoemaker	20,0-23,0	65,5 -70,6	15,1-18,8

Fusarium avenacrum (Fr.) (Sacc)	0	47,4-51,4	0
F. solani App. et Wr.	0	23,9-26,0	0
Verticillum dahlia Kleb	16,0-18,9	47,9-52,0	13,6-15,5
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary	0	0	0
F. culmorum (W.G.Sm.) Sacc.	0	0	0
F. oxysporum (Schlecht. Snyd. et Hans)	24,3-28,8	39,9- 48,0	19,7-21,8

У всех представленных препаратов выявлены антифунгальные свойства. Наибольшей активностью обладал BtH 10 56, у BtH 1 800/15 она была слабее в 2 раза, у препарата BtH 14 7-1/23А — в 2-3 раза по сравнению с BtH 10 56. Проявилась избирательность по отношению к разным видам грибов. Наиболее чувствительным к действию препаратов оказался B. cinerea . Несколько слабее BtH 10 56 действовал на Pythium spp. и Bipolaris sorokiniana . На Fusarium culmorum и Sclerotinia sclerotiorum штаммы не оказывали действия . У гриба S. sclerotiorum отмечена защитная реакция, проявившаяся в образовании покоящихся структур (склероции), позволяющих сохраняться в течение длительного времени (113).

Полифункциональная активность препарата на основе BtH 10 была ранее подтверждена в полевых условиях при обработке посадок земляники сорта Царскосельская (85). Биологическая эффективность против землянично-малинного долгоносика на 10-е сут составляла 79,4 %, на 20-е сут — 83,5 %, против серой гнили на 30-е сут — 80,5 %; число цветоносов увеличилось на 17 %.

Однократная обработка растений земляники в период выдвижения бутонов—начала цветения оказалась эффективной как против земляничномалинного долгоносика, так и против возбудителя серой гнили. В этот период происходит поражение земляники долгоносиком и также основное заражение цветоносов возбудителем серой гнили Botrytis cinerea . (114). Обработка позволяет одновременно бороться и с вредителем ( Anthonomus rubi ), и с возбудителем болезни ( Botrytis cinerea ).

Представленные новые штаммы отличаются высокой эффективностью и технологичностью. Кроме того, они обладают полифункциональ-ными свойствами. Помимо перечисленных штаммов, в институте на основе BtH 10 получены еще штаммы c полифункциональными свойствами: ¹ 25 (выделен из трупа колорадского жука в Ленинградской области), 109/7 (получен посредством многоступенчатой аналитической селекции из штамма 109 (115, 116).

Характеристика штаммов с полифункциональными свойствами приводится в таблице 9.

9. Характеристика полифункциональной активности микробиологических препаратов на основе штаммов BtH 10 (лабораторный опыт) (108, 115, 116)

Штамм	Инсектицидная активность ( Leptinotarsa desemlineata ), %	Ингибирующая активность ( Bot-rytis cinerea ), %	ф иторегуляторная активность, % (салат Latuca sativa L., сорт Успех)
			всхожесть высота ростков длина корней

¹ 56	96,2-100	100	118	128	140
¹ 25	97,9-100	100	109	129	140
¹ 109/7	98,5-100	100	103	128	142

Представленные штаммы ¹ 25 и 109/7 по полифункциональной активности были сопоставимы со штаммом ¹ 56 и перспективны для разработки новых полифункциональных препаратов-прототипов.

Таким образом, препараты-прототипы не уступают известным препаратам — битоксибациллину, бациколу и бактокулициду, более того, они эффективнее и технологичнее. При этом разработана новая полусинтетиче-ская модифицированная среда MMBt (117), позволяющая ускорять процесс производства и снижать его стоимость. Препараты также полифункцио-нальны (инсектицидная, антифунгальная и фиторегуляторная активность), что расширяет сферу их применения.

Итак, уникальные свойства Bacillus thuringiensis (Bt) (специфичность, технологичность, полифункциональность) привели к тому, что эта бактерия стала основой для наиболее используемых в мире биологических пестицидов. Новые штаммы Bacillus thuringiensis , описанные во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии, перспективны как основа уникальных эффективных и технологичных биопрепаратов с полифункцио-нальными свойствами, включающими инсектицидную, антифунгальную и фиторегуляторную активность. К настоящему времени число биопрепаратов с комплексным действием невелико, и создание таких полифункцио-нальных продуктов крайне актуально. Новые перспективы для этого направления открывает использование современных геномных и биоин-форматических подходов. Применение Вt в микробиологических препаратах позволяет расширить ассортимент и сферу применения микробиологических средств защиты растений, а также снизить пестицидную нагрузку на окружающую среду и улучшить экологическую обстановку.

1 ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии,