Инсектицидные свойства Bacillus thuringiensis var. Israelensis. Сообщение II. Сравнительный морфологический и молекулярно-генетический анализ кристаллогенных и акристаллогенных штаммов

Бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis - основной агент биологической защиты от кровососущих двукрылых насекомых, многие из которых являются переносчиками трансмиссивных болезней сельскохозяйственных животных. Штаммы-продуценты для производства инсектицидных препаратов выделяют из природных объектов, получают посредством селекции ранее использованных изолятов, скрининга генетических коллекций и генной или геномной инженерии. При этом вопрос сохранности и контроля практически ценных свойств штаммов остается ключевым. Биопрепараты представляют существенный интерес в связи с их значительными преимуществами перед химическими пестицидами и рассматриваются в современных системах сельского хозяйства в качестве экологически и социально приоритетных альтернатив агрохимикатов. В представленной работе нами выполнен первый комплексный сравнительный анализ кристаллогенных и акристаллогенных вариантов Bacillus thuringiensis var. israelensis (BtH14), выделенных после хранения штамма в разных режимах. У кристаллогенных вариантов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) впервые выявлены гены, кодирующие целевые инсектицидные токсины - Cry4 и Сry11, и показано, что акристаллогенные формы этих генов лишены. Установлено, что у кристаллогенных вариантов культуральная жидкость приблизительно в 7000 раз активнее в отношении личинок Aedes aegypti чем у акристаллогнных. Целью настоящего исследования было сопоставление морфологических, биохимических, технологических, ларвицидных свойств кристаллогенных и акристаллогенных штаммов бактерии (BtH14) и проверка наличия у них генов, кодирующих энтомоцидные токсины Сry, которые относятся к ключевым детерминантам вирулентности. Изучали штаммы 404, 87 (хранились 28 лет методом лиофилизации, затем 2 года в пробирках на скошенном рыбном агаре - РА с пересевом каждые 6 мес), штамм 7-1/23 (хранился 28 лет в кристаллах NaСl, затем 2 года в культуральной жидкости - КЖ при температуре 3 °С). Культуры рассевали методом истощающегося мазка на РА в чашках Петри. На 7-е сут роста при 30 °С отбирали кристаллогенные (404/14, 87/21, 7-1/23-4) и акристаллогенные (404/19, 87/33, 7-1/23-8) варианты методом световой микроскопии, используя краситель черный анилиновый. У вариантов не выявили различий по морфологии колоний на РА в чашках Петри: колонии были плоские, матовые, серовато-белые, шероховатые, округлые, структура мелкозернистая, консистенция вязкая. Изучение морфологии вегетативной культуры, основных биохимических свойств (образование ацетилметилкарбинола, лецитиназы, использование углеводов, расщепление крахмала и др.) и оценка титра на дрожже-полисахаридной среде также не показали различий. Продуктивность вариантов 404/14, 87/21, 7-1/23-4 и 404/19, 87/33, 7-1/23-8 была в пределах соответственно (3,36-4,02)×109 и (3,74-4,13)×109 КОЕ/мл. Ларвицидная активность кристаллогенных вариантов, которая выражалась в ЛК50 для L4 Aedes aegypti , составляла (0,12-0,16)×10-3 %, акристаллогенные варианты были неактивными в пределах следующих общепринятых разведений (×10-3 %): 1,0; 0,5; 0,25; 0,125 и 0,06. Их 1 % суспензия (в 7000 раз большая концентрация) вызывали гибель 22-39 % личинок комаров через 24 ч, тогда как та же концентрация активных вариантов приводила к 100 % гибели насекомых уже через 15 мин. Обнаружено, что КЖ акристаллогенных вариантов через 12 ч образовывала осадок и надосадочный слой, а кристаллогенных - оставалась в состоянии взвеси. Исследуемые варианты BtH14 были также впервые проанализированы на наличие генов, кодирующих инсектицидные токсины. Результаты амплификации с Bti-специфичными праймерами подтвердили принадлежность кристаллогенных и акристаллогенных вариантов к BtH14. Установлено, что варианты 404/14, 87/21, 7-1/23-4 несут гены, кодирующие инсектицидные токсины Cry4 и Cry11, в то время как акристаллогенные варианты 404/19, 87/33, 7-1/23-8 лишены этих генов, что согл