Инсулиноподобные факторы роста и активность протеасом в опухолях эндометрия

В настоящее время сформировано понятие о системе инсулиноподобных факторов роста, в которую входят сами инсулиноподобные факторы роста (ИФР) – ИФР-I и ИФР-II, рецептор ИФР I типа, а также 6 белков, связывающих инсулиноподобные факторы роста (IGFBPs). С этой системой функционально связаны протеиназы, расщепляющие IGFBPs, среди которых важное значение отводят белку, ассоциированному с беременностью – PAPP-A (pregnancy-associateds plasma protein) [5]. Роль ИФР, их рецептора и IGFBPs в патогенезе рака эндометрия представляется многоплановой. Автономная или индуцированная эстрадиолом и тамоксифеном продукция ИФР гиперплазированным эндоме- трием или опухолью при наличии рецепторов к ИФР в тканях может приводить к избыточной пролиферации клеток, их пониженной чувствительности к проапоптотическим стимулам и повышенной клеточной подвижности. При наличии опухолевых клеток это может привести к значительной инвазии в нормальные ткани и метастазированию. Существенную роль в регуляции биодоступности ИФР отводят IGFBPs, экспрессия которых регулируется эстрогенами, прогестероном, специфическими протеазами и самими ИФР [5, 10, 12, 13, 15].

Необходимо отметить, что внутриклеточная деградация белков в протеасомах является конечным этапом во многих физиологических и патологических процессах. В убиквитин-протеасомной системе расщепляются аномальные или короткоживущие регуляторные белки, в том числе молекулы путей передачи сигналов от ростовых факторов и, частично, сами рецепторы ростовых факторов [6]. Убиквитин-протеасомная система деградации представлена олигопептидом убиквитином и протеасомой – полиферментным комплексом, который обладает трипсиноподобной, химотрипсиноподобной, каспазной и АТФ-азной активностью. Имеется определенная взаимосвязь между компонентами ИФР-системы и активностью протеасом в клетках. Выявлено, что внутриклеточная деградация основного белка, связывающего ИФР во внеклеточной жидкости и индуцирующего апоптоз в клетке при его накоплении в ядре – IGFBP-3, зависит от активности убиквитин E1-лигазы – компонента убиквитин-протеасомной системы деградации белков [14].

Большинство моментов, касающихся роли ИФР-опосредованного сигнального пути в патогенезе предрака и рака эндометрия, остаются неисследоваными, а результаты, полученные преимущественно на клеточных опухолевых линиях, нельзя прямо экстраполировать на реальные опухоли. По-видимому, в реализации эффектов ИФР в опухолях эндометрия большое значение имеет строма опухолей. Мало изучены клинические ассоциации компонентов ИФР-опосредованного сигнального пути при раке эндометрия. Нет данных о взаимосвязи системы внутриклеточной деградации белков и состояния ИФР-системы в опухолях эндометрия. Исследования в этом направлении представляются достаточно актуальными как в плане разработки фундаментальных аспектов патогенеза рака эндометрия, так и улучшения прогнозирования заболевания. Поэтому целью исследования явилось изучение уровня компонентов ИФР-системы в опухолях эндометрия во взаимосвязи с активностью протеасом и анализ данных с основными клинико-морфологическими параметрами у больных раком эндометрия.

Материал и методы

Основную группу составили 33 больных раком эндометрия I–II стадии (средний возраст 56,4 ± 1,9 года), проходивших хирургическое или комбинированное лечение в клиниках ГУ «НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН». При гистологическом исследовании эндометриоидный рак верифицирован в 32 образцах, неэндометриоидный (мезодермоидного происхождения) – в 1 случае. Больные были распределены следующим образом: по стадии заболевания – у 2 пациенток выявлен рак in situ, у 22 – I стадия, у 9 – II стадия процесса. По степени дифференцировки: у 11 больных выявлены высокодифференцированные аденокарциномы, у 17 – умереннодифференцированные, у 4 – опухоли с низкой степенью дифференцировки. По менопаузальному статусу: 6 больных репродуктивного возраста, 8 пациенток находились в перименопаузе, 19 – в постменопаузе.

Для сравнения была сформировала группа из 8 больных с гиперпластическими процессами эндометрия (6 женщин с типичной и 2 – с атипичной гиперплазией эндометрия, средний возраст – 48,9 ± 2,8 года). У всех больных, кроме вышеуказанных клинических параметров были проанализированы возраст, состояние менструальной и репродуктивной функции, менопаузальный статус в соответствии с критериями ВОЗ (1990) и Международного общества по изучению менопаузы (1999), наличие ожирения с подсчетом индекса массы тела, наличие гипертонической болезни и сахарного диабета.

Активность протеасом определяли у 7 больных раком эндометрия в соответствующих образцах опухолевой и неизмененной ткани по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC [2]. Визуально не измененную ткань эндометрия брали на расстоянии не менее 1 см от границы опухоли. Реакционная смесь содержала 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ. Реакцию проводили при 37oС в течение 20 мин. Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре Hitachi-850 (Япония) при значениях возбуждающей длины волны 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу удельной активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин на 1 мг белка.

В таблицах все результаты представлены как m±M, где m – среднее выборочное, M – ошибка среднего. Значимость различий показателей в исследуемых группах определяли при помощи непараметрического критерия Манна–Уитни. Степень и значимость корреляционной связи между показателями оценивали с помощью коэффициента Спирмена. Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

При анализе показателей ИФР-I, IGFBP-3 и PAPP-A в опухолевой ткани установлено, что уровень ИФР-I и основного белка, связывающего ИФР, IGFBP-3, в опухолях эндометрия был значительно выше, чем в гиперплазированном эндометрии. Аналогичная тенденция выявлена и для PAPP-A (табл. 1). Необходимо отметить, что, в отличие от других изученных параметров, в группе больных раком эндометрия в 12,1 % встречались PAPP-A-отрицательные опухоли, в то же время в части опухолей уровень экспрессии этого белка был очень высок (более 10 нг/мг белка – в 27,3 %) при среднем значении 8,58 ± 1,27 нг/мг белка (табл. 1). Активность протеасом была достоверно выше в опухолевой ткани по сравнению с аутологичной неизмененной тканью – 58,5 ± 18,4×103 Ед/мг белка и 28,4 ± 2,60×103 Ед/мг белка соответственно.

При оценке состояния ИФР-системы во взаимосвязи с основными клиническими параметрами было выявлено, что уровень IGFBP-3 у больных раком эндометрия в постменопаузе был существенно выше по сравнению с больными репродуктивного возраста и в перименопаузе (табл. 2), что подтверждается и данными, полученными при проведении корреляционного анализа (табл. 3). Аналогичная тенденция выявлена и для PAPP-A. Кроме того, уровень ИФР-I в неинвазивных карциномах был значительно ниже по сравнению с инвазивными. При анализе изученных параметров со степенью дифференцировки опухолей выявлено, что в низкодифференцированных опухолях высокий уровень IGFBP-3 сочетался с низким уровнем PAPP-A.

При проведении корреляционного анализа выявлено, что со стадией заболевания достоверно коррелировал уровень IGFBP-3 в опухоли (табл. 3). Наличие гипертонической болезни также коррелировало с уровнем IGFBP-3. Необходимо отметить, что протеасомная активность в нетрансформированной ткани значительно растет с возрастом больных раком эндометрия, что подтверждается наличием сильной корреляционной связи (r=0,941, p=0,005). Была выявлена закономерная взаимосвязь между ИФР-I и IGFBP-3 в опухолевой ткани. Кроме того, уровень ИФР-I в опухоли коррелировал с активностью протеасом в нетрансформиро-ванной ткани.

Таблица 1

Уровень ИФР-I, IGFBP-3 и PAPP-A в гиперплазированном эндометрии и опухолях эндометрия (M±m)

Группы больных	ИФР-I, нг/мг белка	IGFBP-3, нг/мг белка	PAPP-A, нг/мг белка
Рак эндометрия	0,52 ± 0,06*	4494 ± 639*	8,58 ± 1,27
ГПЭ	0,34±0,03	1488±380	4,94±3,29

Примечание: ГПЭ – гиперпластические процессы эндометрия, * – различия статистически значимы по сравнению с ГПЭ, p<0,05.

Таблица 2

Уровень ИФР-I, IGFBP-3 и PAPP-A в опухолях эндометрия во взаимосвязи с основными клинико-морфологическими параметрами (M±m)

Критерии сравнения	ИФР-I, нг/мг белка	IGFBP-3, нг/мг белка	PAPP-A, нг/мг белка
Менопаузальный статус:
репродуктивный возраст	0,625 ± 0,210	2455 ± 317	5,79 ± 1,55
перименопауза	0,410 ± 0,130	1912 ± 239	7,02 ± 1,56
постменопауза	0,51 ± 0,070	6333 ± 953**	10,3 ± 2,1
Стадия опухолевого процесса:
Рак in situ	0,221 ± 0,069*	1848 ± 216*	8,40 ± 0,80
I стадия	0,540 ± 0,080	4028 ± 596	8,48 ± 1,60
II стадия	0,530 ± 0,110	6655 ± 597	9,58 ± 3,10
Степень дифференцировки опухоли:
высокая	0,635 ± 0,130	2527 ± 358	7,30 ± 1,60
умеренная	0,440 ± 0,070	4800 ± 659	9,94 ± 2,00
низкая	0,491 ± 0,160	10193 ± 4009***	2,14 ± 1,50****

Примечание: * – значимость различий по сравнению с I и II стадией заболевания, p<0,05; ** – значимость различий по сравнению с больными репродуктивного возраста и в перименопаузе, p<0,05; *** – значимость различий по сравнению с высокодифференцированными опухолями, p<0,05; ***** – значимость различий по сравнению с высоко- и умереннодифференцированными опухолями, p<0,05.

Таблица 3

Спектр корреляционных связей и коээфициент корреляции Спирмена между изученными параметрами в группе больных раком эндометрия

Корреляционные связи	R	p
Возраст – IGFBP-3	0,580	0,0005
Возраст – протеасомная активность в нетрансформированной ткани	0,941	0,005
Гипертоническая болезнь – IGFBP-3	0,482	0,005
Стадия – IGFBP-3	0,560	0,040
ИФР-I – протеасомная активность в нетрансформированной ткани	0,886	0,019
ИФР-I - IGFBP-3	0,432	0,011

Примечание: R – коэффициент корреляции Спирмена.

Полученные данные об уровне компонентов ИФР-системы в опухолях эндометрия свидетельствуют о значительном образовании ИФР-I в опухолях эндометрия. Для сопоставления собственных результатов с данными литературы содержание ИФР-I в ткани эндометрия было рассчитано на 1 мл супернатанта, в результате чего было выявлено, что в супернатанте ткани рака эндометрия содержится достаточно высокое количество ИФР-I – 1,28 ± 0,17 нг/мл. Для сравнения, уровень ИФР-I в супернатанте моно-нуклеаров периферической крови на 5-й день инкубации (в логарифмическую фазу роста) составил в среднем 1,59 нг/мл, в супернатанте клеток человеческой остеосаркомы (U2-OS) – в среднем 2, 192 нг/мл [11]. Также нами было показано, что уровень этого белка в карциномах был значительно выше, чем в гиперплазированном эндометрии.

Достаточно высокие уровни ИФР-I, IGFBP-3 и PAPP-A в опухолевой ткани, по-видимому, свидетельствуют об активации ИФР-системы у больных раком эндометрия. Анализируя данные литературы, можно отметить исследование C.C. Camacho-Hubner et al. (2005), в котором было показано, что клеточная линия карциномы эндометрия HEC-1B секретирует 3 типа IGFBPs: IGFBP-1, IGFBP-2 и IGFBP-3, причем выявлена ИФР-I-зависимая активация синтеза IGFBP-3 [3], что согласуется с полученными нами данными о сочетанном высоком уровне экспрессии ИФР-I и IGBP-3 в опухолях эндометрия. Необходимо отметить, что оценка уровня как ИФР-I, так и ИФР-II в опухолевой ткани при раке эндометрия была бы более целесообразна, так как, по данным L.C. Murphy (1994), в аденокарциномах эндометрия экспрессируются значительные количества ИФР-II [5].

В отношении PAPP-A можно отметить, что этот гликопротеин обладает иммуносупрессивными свойствами, и ранее считалось, что он продуцируется исключительно клетками трофобласта. Поэтому основная область использования данного маркера – диагностика и оценка эффективности лечения трофобластической болезни, выявление аномалий течения беременности; вместе с определением свободной b-субъединицы хорионического гонадотропина оценка РАPP-A в сыворотке крови используется в пренатальном скрининге на синдром Дауна [17]. Однако дальнейшие исследования показали, что данный белок обладает свойствами специфической протеиназы IGFBP-4 и -5, секретируется не только клетками трофобласта, но и обнаруживается в фолликулярной, семенной и простатической жидкостях, продуцируется стромальными клетками нормального, гиперплазированного и малигнизированного эндометрия, а также рядом опухолей эпителиального происхождения [7–9, 16]. Причем в малигнизированном эндометрии уровень экспрессии PAPP-A был значительно выше по сравнению с гиперплазированным (иммуногистохимическое исследование) [8], что созвучно полученным нами данным. В то же время в нашем исследовании показано, что в части опухолей PAPP-A не продуцируется.

Полученные взаимосвязи между компонентами ИФР-системы, в частности между уровнем ИФР-I и протеасомной активностью, в нетранс-формированной ткани позволяют предположить возможный контроль содержания ИФР-I в опухоли его выработкой в неизмененной ткани при участии внутриклеточной протеолитической системы. Такой вариант паракринной регуляции достаточно распространен среди опухолей, в том числе есть примеры и в отношении рака эндометрия [18].

Интересны данные, полученные в отношении взаимосвязи состояния ИФР-системы с основными клинико-морфологическими параметрами у больных раком эндометрия. Связь IGFBP-3 и протеасомной активности в нетрансформиро-ванной ткани с возрастом и менопаузальным статусом у больных раком эндометрия отражает определенные особенности в функционировании ИФР-системы и системы внутриклеточной деградации белков у этих больных, поскольку у здоровых взрослых людей уровень обоих ИФР и IGFBP-3, по крайней мере в сыворотке крови, не зависел от возраста [1]. В отношении протеа-сомной активности в литературе представлены достаточно разнородные данные, однако для большинства клеточных линий (фибробласты человека, кератиноциты мыши) и тканей (в основном печень, селезенка и мозг крыс и мышей) показано зависимое от возраста снижение протеасомной активности [4]. Также нами было показано, что уровень IGFBP-3 коррелирует с наличием гипертонической болезни, которая у больных раком эндометрия наблюдается не изолированно, а чаще всего является проявлением метаболического синдрома. Кроме того, в последующем будет представлять определенный интерес изучение взаимосвязи компонентов ИФР-системы с уровнем инсулинемии. Уровень ИФР-I в неивазивном раке эндометрия был значительно ниже, чем в инвазивном. Причем уровень этого белка был практически одинаков при I и II стадии заболевания, в то время как уровень IGFBP-3 прогрессивно возрастал. Важно отметить, что в низкодифференцированных карциномах при высоком уровне IGFBP-3 уровень PAPP-A значительно снижался.

Таким образом, получены новые данные о достаточно высокой экспрессии ИФР-I и IGFBP-3 в опухолях эндометрия по сравнению с гиперплазированным эндометрием, о значительной вариации экспрессии PAPP-A в опухолях эндометрия, в том числе о снижении уровня PAPP-A при высоком уровне IGFBP-3 в низкодифференцированных карциномах. Уровень ИФР-I в неивазивном раке эндометрия был значительно ниже, чем в инвазивном. Выявлена связь IGFBP-3 и протеасомной активности в нетрансформированной ткани с возрастом и менопаузальным статусом у больных раком эндометрия, а также IGFBP-3 c наличием гипертонической болезни. Полученные результаты о взаимосвязи уровня ИФР-I, IGFBP-3, PAPP-A в опухолевой ткани, активности протеасом в опухолевой и нетрансформированной ткани с основными клинико-морфологическими параметрами у больных раком эндометрия представляют значительный интерес, однако необходимо продолжение исследований как в плане расширения спектра исследуемых показателей (ИФР-II, IGFBP-4 и IGFBP-5, более широкий спектр клинических показателей), так и в плане увеличения количества обследованных больных.