Интегральная оценка окислительно-восстановительных процессов в тканях печени крыс на фоне механической травмы глаза

                           УДК 66.094.1+617.7-001.3(07)

В результате механической травмы глаза и повреждения гематоофтальмиче-ского барьера возникает воспалительный процесс и, как следствие, оксидативный стресс – это состояние организма, развивающееся на фоне перепроизводства свободных радикалов при нарушении эффективности антиоксидантной защиты [1, 2]. Воспалительный процесс стимулирует выработку в организме цитокинов, которые индуцируют повышенное образование кор-тикотропин-рилизинг гормона, адренокорт-котропного гормана, глюкокортикоидов, адреналина и других биологически активных соединений. Все это провоцирует интенсификацию окислительных процессов в организме в целом и отчасти сказывается на функционировании печени [3, 4].

Одной из мишеней свободных радикалов, интенсивно образующихся при окси-дативном стрессе, являются клеточные мембраны, повреждение которых неминуемо сказывается на их функциях: повышается жесткость мембран, изменяется активность мембранных белков, нарушается мембранный транспорт, в том числе и работа ионных насосов [5].

Одной из важнейших мишеней окислительного стресса в гепатоцитах является митохондриальная ДНК, при её нарушении происходит изменение механизмов окислительного фосфорилирования, что ведет к уменьшению выработки АТФ и гибели клетки. В целом, при истощении резервов АТФ при окислительном стрессе ксантинокси-даза цитозоля способна продуцировать супероксидный радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал, гипохлорит, хлорамины, синглетный кислород, пероксирадикал [6].

Печень имеет и защитные антиоксидантные системы, которые препятствуют эффектам окислительного стресса. Глюта- тионпероксидаза и каталаза обеспечивают разрушение перекиси водорода, суперок-сиддисмутаза обеспечивает связывание су-перокидного радикала, глютатионперокси-даза и глютатионредуктаза участвуют в элиминации других кислородных радикалов. Известно, что эти ферменты определяют устойчивость гепатоцитов к действию свободных радикалов в разных зонах печеночных долек. При действии свободных радикалов не обязательна гибель клеток, но реален эффект повышения чувствительности клеток к другим альтерирующим агентам [7].

Оценку окислительного гомеостаза организма, как правило, проводят путем исследования активности ферментов системы ПОЛ-АО, но на практике целесообразно использовать интегрированные показатели, что повышает информативность результатов исследований и позволяет достоверно оценить невысокие отклонения в антиоксидантном статусе организма.

Таким образом, цель нашего исследования состояла в изучении динамики коэффициентов оксидативного стресса для интегральной оценки антиоксидантного статуса тканей печени крыс при индуцированном механической травмой глаза окси-дативном стрессе.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи: определить в динамике активность каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), глутатио-пероксидазы (ГП) и глутатионредуктазы (ГР), а также концентрации малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК) в тканях печени интактных крыс и крыс с механической травмой глаза, провоцирующей оксидативный стресс; рассчитать в динамике коэффициенты оксидативного стресса и оценить эффективность применения различных методов терапии травмы глаза.

Материалы и методы

Исследование проводили на беспородных белых половозрелых здоровых крысах-самцах шестимесячного возраста, массой

220–240 г в количестве 150 штук, которые содержались в стандартных условиях вивария. Все животные были поделены на пять групп по 30 крыс в каждой группе. 1-я группа крыс – интактные животные. 2, 3, 4 и 5-я группы – экспериментальные, где всем животным наносили проникающее ранение обоих глаз. Животным 2-й группы не проводили терапию механической травмы глаза. Крысы 3-й группы получали стандартную терапию травмы глаза, животные 4-й группы – стандартную терапию с добавлением инъекций кверцетина внутрибрюшинно и 5-й группы – только инъекции кверцетина. Подробная методика проведения эксперимента представлена нами в ранее опубликованной работе [8, 9].

Активность каталазы, СОД, ГП и ГР, а также концентрации МДА и ДК в тканях печени исследовали стандартными методами до начала опыта, а также на 1, 3, 5, 7 и 14-е сутки эксперимента [9].

В соответствии с этическими нормами крыс декапитировали под эфирным наркозом, проводили извлечение печени, из которой готовили гомогенаты [9].

Для интегральной оценки гомеостаза у крыс использовали коэффициенты оксида-тивного стресса: коэффициент, выражающий отношение активности каталазы к активности СОД; антиоксидантно-прооксидантный индекс (АПИ), выражающий соотношение активности каталазы к концентрации МДА; коэффициент отношения концентрации МДК к концентрации ДК и локальный антиоксидантный индекс (ЛАИ), представляющий собой отношение произведения активностей каталазы и СОД к концентрации МДА [10].

Полученный цифровой материал подвергали статистической обработке путем непараметрического статистического анализа.

Основные результаты

Динамика коэффициентов оксидатив-ного стресса в тканях печени крыс представлена в таблице 1.

Таблица 1. Динамика коэффициентов окислительного стресса в тканях печени

Table 1. Dynamics of the coefficients of oxidative stress in liver tissues

Коэффициент	Сутки эксперимента	Группы животных
		1	2	3	4	5
МДА/ДК	0	0,43	0,461	0,44	0,43	0,442
	1	0,45	0,441	0,451,2	0,451	0,43 1,3,4
	3	0,42	0,481	0,461,2	0,461,2	0,461,2
	5	0,44	0,461	0,441,2	0,431,2	0,44 1,2,4
	7	0,45	0,421	0,381,2	0,36 1,2,3	0,38 1,2,4
	14	0,44	0,431	0,451,2	0,442	0,42 1,2,3,4
Каталаза/МДА	0	5,01	4,841	4,93	5,01	5,062
	1	4,75	4,381	4,311	4,381	4,431
	3	4,97	3,171	3,491,2	3,72 1,2,3	3,23 1,2,3,4
	5	4,85	2,511	2,741,2	3,29 1,2,3	2,64 1,2,3,4
	7	4,83	2,111	2,591,2	3,02 1,2,3	2,34 1,2,3,4
	14	4,91	1,731	3,961,2	4,87 1,2,3	2,91 1,2,3,4
Каталаза/СОД	0	0,29	0,291	0,292	0,291,3	0,292,5
	1	0,29	0,29	0,281,2	0,293	0,293
	3	0,29	0,281	0,281,2	0,292,3	0,28 1,2,3,4
	5	0,29	0,271	0,271	0,28 1,2,3	0,26 1,2,3,4
	7	0,29	0,261	0,261	0,361	0,26 1,2,3,4
	14	0,30	0,251	0,291,2	0,291,2	0,29 1,2,3,4
ЛАИ	0	1000,29	971,14	988,17	1001,873	1014,292
	1	952,04	848,681	840,351,2	852,301,2,3	859,87 1,2,3,4
	3	993,16	591,601	662,311,2	709,561,2,3	607,30 1,2,3,4
	5	970,59	449,901	497,291,2	618,77 1,2,3	471,79 1,2,3,4
	7	967,79	344,301	444,751,2	545,251,2,3	389,34 1,2,3,4
	14	984,86	271,171	748,091,2	959,351,2,3	457,37 1,2,3,4

Примечание. В таблице различия достоверны при P < 0,05: 1 – по сравнению с показателями интактных животных; 2 – по сравнению с показателями животных 2 группы; 3 – по сравнению с показателями животных 3 группы; 4 – по сравнению с показателями животных 4 группы.

В тканях печени коэффициент МДА/ДК у крыс 1-й группы на протяжении всего эксперимента колебался не значительно. У животных 2, 3 и 4-й групп также на протяжении всего опыта отмечались колебания коэффициента МДА/ДК в сторону снижения и увеличения и значения достоверно отличались от интактных животных, однако на 14-е сутки этот показатель был сопоставим с показателями 1-й группы. Следует заметить, что коэффициент МДА/ДК у крыс 3-й группы достоверно начиная с первых суток отличался не только от интактных крыс, но и крыс 2-й группы. В тканях печени крыс 5-й группы начиная с 5-х суток опыта выявлена четкая тенденция снижения коэффициента МДА/ДК по сравнению с контролем и другими группами животных, и на 14-е сутки опыта он был ниже на 27,3 % по сравнению с интактными крысами. Низкое значение коэффициента МДА/ДК по сравнению с нормой говорит, на наш взгляд, о превалировании продуктов первичного окисления над вторичными, что отражает высокую интенсивность работы экзогенного антиоксиданта кверцетина и эндогенных антиоксидантных ферментов.

В тканях печени коэффициент катала-за/МДА у животных 1-й группы на протяже- нии всего опыта был примерно на одном уровне. У животных 2-й группы коэффициент каталаза/МДА на протяжении всего опыта достоверно отличался от контрольной группы и имел тенденцию к снижению и на 14-е сутки был ниже, чем у интактных крыс на 64,8 %. В 3-й группе коэффициент каталаза/МДА в тканях печени интенсивно снижался до 7-х суток опыта, а на 14-е сутки возрос и был ниже, чем у интактных крыс на 19,3 %. Начиная с 3-х суток и до 14-х данный показатель 3-й группы крыс достоверно отличался от показателей 1-й и 2-й групп. У крыс в 4-й группе наблюдалась аналогичная 3-й группе динамика коэффициента каталаза/МДА в тканях печени, но с менее интенсивным снижением. На 14-е сутки коэффициент каталаза/МДА у животных 4-й группы практически соответствовал показателю интактных крыс. В целом, начиная с третьих суток опыта коэффициент каталаза/МДА в тканях печени у крыс 4-й группы достоверно отличался от показателей 1, 2 и 3-й групп. У крыс 5-й группы в целом динамика коэффициента каталаза/МДК похожа на 3-ю и 4-ю экспериментальные группы, но снижение показателя до 7-х суток происходит более интенсивно, сопоставимо с тенденцией 2-й группы, но затем на 14-е сутки наблюдается подъем. На 14-е сутки коэффициент каталаза/МДА в тканях печени у крыс 5-й группы ниже чем в контроле на 40,7 %. Также, с 3-х по 14-е сутки опыта данный коэффициент у крыс 5-й группы достоверно отличается от показателей животных других экспериментальных групп.

В отношении коэффициента каталаза/ СОД в тканях печени у крыс 1, 2, 3, 4 и 5-й групп на протяжении опыта отмечены в основном незначительные колебания с достоверными отличиями между группами. На 14-е сутки у крыс с индуцированным окси-дативным стрессом без терапии (группа 2) отмечен самый низкий коэффициент ката-лаза/СОД (на 16,7 % ниже, чем в контроле), а в остальных группах данный показатель был примерно на одном уровне и сопоставим с контролем.

ЛАИ в тканях печени интактных крыс претерпевал на протяжении эксперимента незначительные колебания, а у животных 2-й группы интенсивно снижался и на 14-е сутки был ниже, чем у интактных крыс на 72,5 %. У крыс 3-й группы ЛАИ в тканях печени до 7-х суток снижался, но менее интенсивно, чем у крыс 2-й группы, а на 14-е сутки наблюдался подъем данного показателя, и он был ниже по сравнению с контролем на 24,0 %. ЛАИ у животных 3-й группы достоверно отличался от контроля и показателей животных 2-й группы с первых суток и до окончания эксперимента. У крыс 4-й группы в целом динамика коэффициента ЛАИ похожа на 3-ю экспериментальную группу, но снижение показателя до 7-х суток происходит менее интенсивно, а затем, на 14-е сутки, наблюдается подъем, и ЛАИ животных 4-й группы сопоставим с контролем. ЛАИ крыс 5-й группы имеет динамику похожую на 3-ю и 4-ю группу, но с более интенсивным снижением показателя до 7-х суток и менее интенсивным подъемом на 14-е сутки. На момент окончания опыта ЛАИ животных 5-й группы ниже, чем в контроле на 53,6 %. Данный коэффициент у крыс 5-й группы начиная с первых суток достоверно отличается от показателей остальных группы.

Обсуждение

Механическая травма глаза является стимулятором окислительных процессов в организме, так как токсичные продукты аутолиза поврежденных тканей поступают в кровь и интенсифицируют окисление и выработку свободных радикалов. Это нарушает окислительно-восстановительное равновесие в организме, что отражается на состоянии ферментов системы перекисного окисления липидов – антиоксидантов. При этом в тканях организма снижается активность каталазы, СОД, ГП и ГР, но возрастает концентрация МДА И ДК. Ткани печени не являются исключением и, соответственно, реагируют на механическую травму глаза.

Применение различных видов терапии моделирует окислительный гомеостаз тканей печени, и расчет индексов оксидатив-ного стресса позволяет выявить незначительные колебания пошатнувшегося окислительно-восстановительного равновесия.

В целом, увеличение коэффициента МДА/ДК говорит об интенсификации процессов окисления и скорости перехода первичных продуктов окисления во вторичные. Снижение же данного коэффициента говорит об эффективной работе эндогенных и экзогенных антиоксидантов, купирующих первичные продукты окисления и предотвращающих их переход в конечные метаболиты.

Снижение коэффициента каталаза/ МДА соответствует картине оксилительно-го стресса: снижается активность антиоксидантных ферментов и возрастает концентрация конечных продуктов окисления. Стандартная терапия механической травмы глаза достаточно эффективно снижает воспаление и интенсивность перекисного окисления, но добавление кверцетина в виде инъекций повышает активность антиоксидантных ферментов и более эффективно повышает после снижения коэффициент каталаза/МДА. Терапия животных только кверцетином не дает таких результатов, так как воспалительные процессы не нивелируются.

Отмечено падение коэффициента каталаза/СОД в тканях печени на фоне механической травмы глаза, что свидетельствует о повышении активности СОД, что говорит о мобилизации защитноприспособительных механизмов, связанных с избыточной продукцией супероксидного аниона-радикала. Избыточная активность СОД ведет к повышенному образованию перекиси водорода, но при этом, по данным нашего исследования, не происходит параллельного увеличения активности каталазы, что может быть связано с повышенной концентрацией водородных ионов, приводящих к возникновению протонированных форм ферментов, обладающих измененной каталитической активностью. Различные виды терапии травмы глаза, примененные нами в эксперименте, к 14-м суткам опыта способствуют возрастанию коэффициента каталаза/СОД.

Коэффициент ЛАИ в тканях печени имел следующую динамику: на фоне окислительного стресса с течением времени снижался, а при различных видах терапии снижался менее интенсивно и только до 7-х суток опыта, но на 14-е сутки проявлял тенденцию к возрастанию. Снижение ЛАИ соответствует интенсификации окислительных процессов в организме, а подъем – превалированию антиоксидантных реакций. Наиболее эффективно стабилизация ЛАИ происходила в группе животных, получавших комплексную терапию травмы глаза с добавлением кверцетина.

Стандартная терапия механической травмы глаза достаточно эффективно подавляет воспалительные процессы, но не стимулирует активность антиоксидантной системы организма, а кверцетин отчасти эффективен в отношении подавления синглетного кислорода и активации антиоксидантных ферментов организма, но не купирует воспаление. Возможно, такой эффект кверцетина обусловлен тем, что использование для подавления окислительного стресса синтетических антиоксидантов может нарушать сигнальную роль свободных радикалов и тем самым ухудшать адаптационные возможности организма.

Заключение

Антиоксидантный статус тканей печени крыс при оксидативном стрессе, вызванном механической травмой глаза, наиболее эффективно стабилизируется при стандартной терапии механической травмы глаза с добавлением кверцетина в виде инъекций.