Интенсивная световая депривация как фактор стрессорных нарушений поведенческих реакций и когнитивных функций в эксперименте

¹ Введение. Актуальность настоящего исследования связана с изменением суточных ритмов современного человека: сменная работа нарушает естественный ритм функционирования организма, и у работающего населения формируется состояние перенапряжения и стресса [1].

В настоящее время повсеместно встречаются нарушения циркадных ритмов организма, связанных с развитием светового десинхроноза. Термин «десин-хроноз» предложил советский биоритмолог B. C. Алякринский (1972). Световой десинхроноз может быть вызван работой вахтовым методом, сменным режимом труда, особенно работой в ночное время, нарушением суточных циклов сна и бодрствования, поздним отходом ко сну. На развитие десинхронозов также влияют частые краткосрочные и длительные командировки, нередко связанные со сменой часовых поясов, а поясное время не всегда соответствует астрономическому [2]. Кроме того, очевидна роль повсеместного увеличения продолжительности светового излучения в течение суток за счет источников искусственного освещения. В городах присутствует мощное световое загрязнение в виде светодиодных ламп уличных фонарей, которые испускают свет зеленого и синего спектра. Постоянное использование гаджетов, особенно непосредственно перед сном, также оказывает пагубное воздействие. Они излучают яркий голубой свет, воспринимаемый организмом как дневной, что в свою очередь негативно влияет на организм.

Цель: изучение изменения поведенческих реакций и когнитивных функций животных в режиме интенсивной световой депривации.

Материал и методы. Экспериментальное исследование проводилось на базе научной лаборатории кафедры нормальной физиологии им. И. А. Чуевско-го Саратовского ГМУ им. В. И. Разумовского согласно принципам биоэтики и правилам лабораторной практики, Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в эксперименте и других научных целях (Страсбург, 1986) ETS N 123, приказу МЗ РФ от 19 июня 2003 г. №267 «Об утверждении правил лабораторной практики», Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (ВОЗ, Женева, 1985), Правилами лабораторной практики (приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. №708н) и с одобрения этического комитета ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России (протокол № 4 от 6 декабря 2016 г.).

Эксперимент выполнен на 36 интактных нелинейных белых крысах-самцах массой 200–250 г. Животные подразделены на две группы: контрольную и опытную, по 18 животных в каждой. Одни и те же животные опытной группы, в свою очередь, на 10-е, 21-е и 30-е сутки подвергались тестированию. Крысы находились в равных условиях и на обычном рационе питания.

Животные круглосуточно подвергались воздействию искусственного освещения, обеспечиваемого лампой дневного света мощностью 60 кВт. Из существующих способов моделирования светового десин-хроноза (12 часов света и 12 часов темнота (LD), постоянное освещение (LL), постоянная темнота (DD)) выбрана наиболее интенсивная модель изменения фоторежима (LL) [3, 4].

Для оценки когнитивных функций животных в стрессовом состоянии выбраны следующие тесты: «Темно-светлая камера» и «Открытое поле». Длительность проведения теста в каждой из установок составляла 5 минут.

Модель «Темно-светлая камера» предназначена для регистрации изменения когнитивных реакций у экспериментальных животных, находящихся под воздействием стрессорного фактора, и позволяет дать оценку, какая из зон — светлая или темная — является для животных комфортной. Установка «Темно-светлая камера» подразделяется на два отсека: темный и светлый, между которыми находится отверстие прямоугольной формы. В ходе эксперимента изначально животное помещается в светлую зону камеры, а темная зона остается открытой. В данном исследовании учитывались такие показатели, как число и латентный период выглядываний из темного отсека в светлый через отверстие в перегородке, количество выходов в светлый отсек, суммарная длительность выглядываний и выходов в освещенную часть камеры. Неспецифическим являлся показатель «количество дефекаций» — число экскрементов, обнаруженных в темной зоне камеры по окончании проведения теста [3].

Тест «Открытое поле» предназначен для количественного измерения элементов когнитивных функций животных, помещенных в открытое пространство (арену), в условиях стресса и позволяет дать оценку выраженности и динамике отдельных компонентов их поведения: степень эмоциональноповеденческой реактивности крыс, их исследовательскую деятельность, оборонительное поведение, общую двигательную активность поведения и т. д. В данной установке регистрировали горизонтальную и вертикальную двигательную активность, число заглядываний в «норки» и обнюхивание отверстий, т. е. специфические показатели, а также число актов дефекации, частоту актов и суммарную продолжительность груминга (сек), т. е. неспецифические компоненты поведения животных [5].

На 30-е сутки животных выводили из эксперимента путем передозировки наркозом (внутримышечная комбинация телазола (Zoetis Inc, США) в дозе 0,1 мл/кг и ксиланита (Нита-Фарм, Россия) в дозе 0,3 мл/кг).

Статистическая обработка полученных в ходе исследования данных осуществлялась при помощи пакета программ Statistica 10.0 (Statsoft, USA). Данные статистического анализа представлены в виде медианы и квартильного диапазона. Для сравнения значений использовался непараметрический показатель: U-критерий Манна–Уитни, так как выборка

Таблица 1

Показатели когнитивных функций белых крыс-самцов при использовании теста «Темно-светлая камера» на различных стадиях развития светового десинхроноза при круглосуточном освещении

Показатель	Контрольная группа	Опытная группа (10-е сутки)	Опытная группа (21-е сутки)	Опытная группа (30-е сутки)
Количество выглядываний из темного отсека в светлый	2,0 (2,0; 3,0)	7,0 (6,0; 8,0) p1<0,001	4,5 (1,0; 7,0) p =0,121 p12=0,047	7,5 (1,5; 13,0) p =0,150 p1=0,718 p34=0,261
Длительность выглядываний из темного отсека в светлый, сек	5,0 (2,0; 11,0)	20,5 (14,0; 32,0) p1<0,001	14,5 (4,0; 18,0) p =0,023 p12=0,006	13,5 (1,5; 100,0) p =0,261 p1=0,750 p34=0,865
Количество выходов из темного отсека в светлый	1,0 (1,0; 2,0)	3,0 (3,0; 4,0) p1<0,001	1,5 (1,0; 2,0) p =0,486 p12<0,001	1,0 (0; 2,5) p =0,539 p1=0,006 p34=0,421
Длительность выходов из темного отсека в светлый, сек	26,5 (22,0; 36,0)	82,0 (70,0; 93,0) p1<0,001	30,0 (26,0; 36,0) p =0,173 p12<0,001	65,0 (0; 129,5) p =0,330 p1=0,783 p34=0,385
Количество актов дефекации	0,5 (0; 1,0)	0 (0; 0) P =0,066	0,5 (0; 2,0) p =0,401 p1=0,038	0 (0; 0,5) p =0,351 p1=0,539 p3=0,235

П р и м еч а н и е : в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили; p1 — различия опытной группы на 10-е, 21-е, 30-е сутки эксперимента по сравнению с группой контроля; p2 — различия между опытными группами на 10-е и 21-е сутки эксперимента; p3 — различия между опытными группами на 10-е и 30-е сутки эксперимента; p4— различия между опытными группами на 21-е и 30-е сутки эксперимента.

не соответствует закону нормального распределения. Различия считались статистически достоверными при р<0,05.

Результаты. Исходя из результатов теста «Темно-светлая камера», можно судить о наличии статистически значимых изменений специфических показателей у животных опытной группы на 10-е сутки стрессорного воздействия по сравнению с показателями у животных группы контроля: «количество выглядываний из темного отсека в светлый» (p₁<0,001), «длительность выглядываний из темного отсека в светлый» (p₁<0,001), «количество выходов из темного отсека в светлый» (p₁<0,001), «длительность выходов из темного отсека в светлый» (p₁<0,001), кроме показателя «количество актов дефекации», являющегося неспецифическим (табл. 1).

У животных опытной группы на 21-е сутки эксперимента по сравнению с животными группы контроля прослеживается статистически значимое различие значений такого показателя, как «длительность выглядываний из темного отсека в светлый» (p1=0,024).

При сравнении показателей животных опытных групп на 10-е и 21-е сутки наблюдения отмечается статистически значимое различие следующих показателей: «количество выходов из темного отсека в светлый» (p2<0,001), «длительность выходов из темного отсека в светлый» (p2<0,001), «количество выглядываний из темного отсека в светлый» (p2 =0,048), «длительность выглядываний из темного отсека в светлый» (p2=0,006), «количество актов дефекации» (p2=0,038), что свидетельствует о значительном снижении исследовательской деятельности и двигательной активности опытной группы животных.

При сравнении показателей животных опытной группы на 30-е сутки интенсивной световой депривации с показателями животных группы контроля и опытных групп на 10-е и 21-е сутки эксперимента статистически значимых изменений не отмечается, кроме специфического показателя «количество выходов из темного отсека в светлый», который имеет достоверные различия по сравнению с аналогичным показателем у животных опытной группы на 10-е сутки эксперимента (p3=0,006). Крайние значения показателей «длительность выглядываний из темного отсека в светлый» (1,5; 100,0) и «длительность выходов из темного отсека в светлый» (0; 129,5) значительно варьируются: это свидетельствует о том, что у животных происходит выраженное нарушение исследовательской деятельности и дезадаптация к длительному воздействию света.

При изучении результатов теста «Открытое поле» на 10-е сутки круглосуточного освещения у животных опытной группы по сравнению с животными группы контроля выявлено статистически достоверное увеличение показателей: «количество пересеченных квадратов» (p1<0,001), «количество стоек» (р1=0,020), «количество актов груминга» (р1=0,020), «количество заглядываний в «норки»» (p1<0,001), что свидетельствует о развитии стрессорных повреждений организма. Рост значений данных показателей свидетельствует об усилении локомоторной активности в условиях стресса. Наблюдается также тенденция к увеличению актов дефекации и общей продолжительности груминга (табл. 2).

На 21-е сутки стрессорного воздействия прослеживается угнетение исследовательской деятельности и двигательной активности крыс данной опытной группы по сравнению с крысами опытной группой на 10-е сутки наблюдения. Это проявляется статистически значимым снижением специфических поведенческих реакций («количество пересеченных квадратов» (р2=0,002), «количество стоек» (р2<0,001),

Таблица 2

Показатели когнитивных функций белых крыс-самцов при использовании теста «Открытое поле» на различных стадиях развития светового десинхроноза при круглосуточном освещении

Показатель	Контрольная группа	Опытная группа (10-е сутки)	Опытная группа (21-е сутки)	Опытная группа (30-е сутки)
Количество пересеченных квадратов	36,5	70,0	40,0	21,0
	(22,0; 46,0)	(58,0; 80,0) p1<0,001	(25,5; 59,0) p =0,326 p12=0,002	(0; 42,5) p =0,418 p1<0,001 p34=0,157
Количество стоек	10,0	41,0	14,0	10,5
	(4,0; 22,5)	(31,0; 45,0) p1=0,001	(9,5; 19,0) p =0,370 p12<0,001	(3,5; 24,0) p =0,976 p1<0,001 p34=0,312
Количество актов дефекации	0,5	1,0	0	1,0
	(0; 2,0)	(0; 2,0) p1=0,976	(0; 0,5) p =0,148 p12=0,126	(0; 1,5) p =0,976 p1=0,885 p34=0,105
Количество актов груминга	1,5	3,5	2,0	3,0
	(0; 3,0)	(2,0; 8,0) p1=0,019	(1,5; 3,0) p =0,272 p12=0,193	(0; 5,5) p =0,214 p1=0,260 p34=0,583
Общая продолжительность груминга,	2,0	7,0	22,0	4,5
сек	(0; 13,5)	(3,0; 25,0) p1=0,157	(16,5; 22,0) p =0,004 p12=0,260	(0; 9,5) p =0,976 p1=0,193 p34=0,002
Количество заглядываний	5,0	8,5	3,0	4,5
в «норки»	(3,0; 6,5)	(8,0; 12,0) p <0,001	(0; 5,0) p =0,053 p1<0,001	(2,0; 6,5) p =0,908 p1=0,001 p3=0,112

П р и м еч а н и е : в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили; p1 — различия опытной группы на 10-е, 21-е, 30-е сутки эксперимента по сравнению с группой контроля; p2 — различия между опытными группами на 10-е и 21-е сутки эксперимента; p3 — различия между опытными группами на 10-е и 30-е сутки эксперимента; p4— различия между опытными группами на 21-е и 30-е сутки эксперимента.

«количество заглядываний в «норки»» (р2<0,001)), в то время как у неспецифических показателей отмечается тенденция к снижению без статистически достоверных изменений. По сравнению с группой контроля сохраняется тенденция к увеличению значений специфических показателей («количество пересеченных квадратов», «количество стоек» и «количество заглядываний в «норки»») и неспецифических показателей («количество актов дефекации», «количество актов груминга» и «общая продолжительность груминга»). Статистически достоверным является увеличение показателя «общая продолжительность груминга» (р1=0,004) у животных опытной группы на 21-е сутки воздействия светового десин-хроноза по сравнению с животными группы контроля.

На 30-е сутки интенсивной световой депривации отмечается тенденция к снижению специфических показателей у животных опытной группы по сравнению с животными группы контроля, в то время как у неспецифических («количество актов дефекации», «количество актов груминга») наблюдается незначительный рост значений. Прослеживается статистически достоверное увеличение таких показателей, как «количество пересеченных квадратов» (р3<0,001), «количество стоек» (р3<0,001) и «количество заглядываний в «норки»» (р3<0,001) по сравнению с 10-ми сутками эксперимента, «общая продолжительность груминга» (р3=0,002) по сравнению с 21-ми сутками эксперимента. Верхний и нижний квартили показателя «количество пересеченных квадратов» (0; 42,5) значительно варьируются. Основываясь на изложенном, можно сделать вывод, что к 30-м суткам интенсивной световой депривации происходит развитие светового десинхроноза, что сопровождается выраженными стрессорными нарушениями.

Обсуждение. Световой десинхроноз, вызванный нарушением суточных циклов, отрицательно сказывается на деятельности организма, в результате чего снижаются когнитивные функции [6]. Стрессорные нарушения, возникающие при развитии светового десинхроноза, вначале могут носить адаптивный характер, а затем привести к полному истощению организма [7].

Рядом авторов была дана оценка таких показателей, как «скрытый уровень эмоциональной тревожности» и «реакции на ориентационно-исследовательскую деятельность», что очень важно учитывать при проведении тестирования [8, 9].

Необходимо отметить, что исследователи и авторы изучали индивидуальные различия и поведенческие реакции крыс с различной устойчивостью к стрессу именно с использованием тестов «Открытое поле» и «Темно-светлая камера» разных модификаций, так как данные тесты позволяют исследовать нейроэтологические (психофизиологические) показатели интактных животных [10–12].

Коллективом авторов было доказано, что изменения поведенческой активности и когнитивных функций в динамике экспериментального десинхроноза могут наблюдаться на половозрелых морских свинках, у которых снижение ориентировочно-исследовательской активности, появление тревожности и пространственной дезориентации в условиях круглосуточного осве- щения наблюдаются на 10-е сутки и прогрессируют к 20-м и 30-м суткам эксперимента [6].

В результате проведенного нами исследования отмечается снижение когнитивных функций уже на 10-е сутки наблюдения, которое выражается в торможении двигательной активности и исследовательской деятельности. Наблюдаемые признаки прогрессируют к 20-м и 30-м суткам наблюдения. На 30-е сутки наблюдается полная дезадаптация животных, что говорит об отсутствии обратимости наблюдаемых изменений.

Данные нашего исследования согласуются с результатами исследований когнитивной способности и поведенческой активности животных при световой и темновой депривации на 10, 21 и 30-е сутки эксперимента [4, 6].

Световой десинхроноз является высокой степенью риска, приводящего к развитию злокачественного заболевания в эксперименте [13]. Кроме того, он может рассматриваться как стрессорный фактор, приводящий к снижению концентрации мелатонина, так как большая часть данного гормона выработается именно в период наименьшей освещенности. Недостаток мелатонина сопровождается увеличением уровня катехоламинов в крови, находящихся под регуляцией адренокортикотропного гормона (АКТГ) [6, 14].

В результате длительного воздействия катехоламинов снижается сигнализация нейронов гиппокампа, и на 21-е сутки происходит нарушение когнитивных функций нервной системы [4, 6].

Учет данных нарушений необходим при прогнозировании последствий в результате планирования работы вахтовым методом, ночных дежурств и многочасовых авиаперелетов.

Выводы:

• 1.    Световой десинхроноз, возникающий при длительной и интенсивной световой депривации, приводит к изменению поведенческих реакций и когнитивных функций белых крыс-самцов, которое носит постепенный характер.

• 2.    У испытуемых животных с воздействием стрес-сорного фактора к 10-м суткам наблюдается максимальный уровень ориентационно-исследовательской активности; на 21-е сутки значения всех показателей, характеризующих специфические функции, уменьшаются, а на 30-е сутки наблюдается полная дезадаптация животных к воздействию стрессора.

• 3.    Постоянное нарушение поведенческих реакций и когнитивных функций животных на всем протяжении эксперимента свидетельствует об отсутствии адаптации животных к интенсивной световой депривации и при длительном воздействии света носит необратимый характер.

Если провести параллель между продолжительностью жизни крыс-самцов и человека, можно сказать, что длительное воздействие источников искусственного света на организм человека может приводить к стойкому продолжительному снижению работоспособности вплоть до срыва адаптационных возможностей организма.

Конфликт интересов. Экспериментальное исследование выполнено в рамках государственного задания ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Министерства здравоохранения РФ по теме «Разработка математической модели для оценки скорости трансформации функциональных изменений в целостном организме при световом десинхро-нозе в необратимые морфологические изменения органов-мишеней в эксперименте». Срок выполнения 2018–2020 гг.

Авторский вклад: концепция и дизайн исследования, утверждение рукописи для публикации — О. Н. Антипова, В. Ф. Киричук, А. Н. Иванов, О. В. Злобина; получение и обработка данных — К. А. Суровцева, В. Д. Анкина, Г. Д. Бондарь, Т. М. Зенкина, М. В. Полюкова; написание статьи — О. Н. Антипова, К. А. Суровцева, В. Д. Анкина, Г. Д. Бондарь, Т. М. Зенкина, М. В. Полюкова; анализ и интерпретация результатов — О. Н. Антипова, К. А. Суровцева, В. Д. Анкина.