Ион-дрейфовый спектрометр с электрораспылительным источником ионов как детектор жидкостного хроматографа

Более сорока лет интенсивно развивается метод плазменной хроматографии [1] в различных вариантах приборного исполнения [2]. К настоящему моменту разработаны и выпускаются ион-дрей-фовые спектрометры (ИДС) как самостоятельные приборы [3], так и в составе аналитических комплексов, например в сочетании с газовыми хроматографами в качестве высокочувствительного селективного и быстродействующего детектора [4]. Также ион-дрейфовые спектрометры применяются в составе сложных исследовательских приборных комплексов ЖХ—ИДС—МС, в которых используются ион-дрейфовые спектрометры как "классического" исполнения [5, 6], с длиной области дрейфа 10–15 см, работающие при атмосферном давлении и напряженности электрического поля в зоне дрейфа порядка 102–103 В/см, так и спектрометры с дл нной областью дрейфа, порядка 0.5–1 м, давлением в единицы торр и напряженностью электрического поля в дрейфовой трубе от 6 до 16 В/см [7–9]. При всех своих положительных качествах (высокой чувствительности, селективности, быстродействии, малых габаритах, массе и простоте) в таком сочетании ИДС является узким местом, т. к. в электроспрей-источнике ионов даже при потоке элюента 3–20 мкл/мин, как в [5, 6], или 0.18–1.5 мкл/мин, как в [7–10], имеют место неис-парившиеся микрокапли анализируемого раствора, что существенно мешает стабильной работе комплекса. Стоит отметить, что использование столь малых потоков распыляемого раствора приводит к получению и малого количества заряженных частиц, поступающих на вход в ион-дрейфовый спектрометр, порядка 107 в секунду (ток порядка 10–12 А) [8], поэтому перед входом в спектрометр подвижности устанавливают накопительную линейную октопольную ловушку, работающую в импульсном режиме.

Стыковка ион-дрейфового спектрометра с жидкостным хроматографом требует решения ряда технических проблем, основной из которых является конденсация элюента, поступающего из жидкостного хроматографа в область источника ионов с электрораспылением, на элементах ион-дрей-фового спектрометра в области распыления, камере десольватации, затворе и непосредственно в зоне дрейфа. Кроме того, необходимо решить проблемы стабильности электрораспыления элюента, согласование его потока, поступающего из хроматографической колонки, и потока распыляемого элюента в источнике ионов. Это позволит использовать существующие методики, применяемые в жидкостной хроматографии при потоках элюента порядка 100–1000 мкл/мин. С другой стороны, в настоящий момент в качестве детектора для ЖХ разработано уже порядка двух десятков типов детекторов — оптические, электрические, электрохимические, радиоактивные и т. д. В свою очередь оптические детекторы для ЖХ делятся на классы по длинам волн. При реализации оптических детекторов учитывают объем ячейки, источник излучения, влияние температурной стабильности детектора и растворителя, влияние вибраций и организацию оптической системы — фильтровые фотометры, широкополосные интерференционные фильтры и другие специализированные элементы оптической системы, реализующей выбранный тип или класс детектора для ЖХ. Приборный комплекс ЖХ—ИДС может иметь самостоятельный интерес, где ион-дрейфовый спектрометр выступает в качестве детектора жидкостного хроматографа, что оказывается полезным, когда оптический детектор жидкостного хроматографа не регистрирует сигнала от разделенных веществ или не может их разрешить, например изомеры [11, 12].

Для исследования аналитических возможностей такого детектора с электрораспылительным высокостабильным источником ионов, работающего с хроматографическими потоками элюента, разработан ион-дрейфовый спектрометр, по структуре представляющий собой "классическую" соосную последовательность узлов прибора: источник ионов, десольватационная камера, затвор Бредбери—Нильсена, дрейфовая камера, коллектор. В качестве электрораспылительного источника ионов для растворов использовано устройство, описанное в [13, 14], работающее при нормальных условиях, как и весь ион-дрейфовый спектрометр. Источник ионов стабильно работает с потоками элюента до 200 мкл/мин. Использованный источник ионов позволяет не перегружать элементы десольватационной камеры и дрейфовой зоны спектрометра каплями раствора и не забрызгивать управляющий затвор Бредбери—Нильсена. Узел электрораспрыления, через который подается элюент и производится откачка излишков распыляемого раствора в виде парогазовой смеси, находится под нулевым потенциалом, соответственно под этим же потенциалом находится и система подачи раствора от жидкостного хроматографа. Такое подключение узла электрораспыления позволяет улучшить электробезопасность работы на комплексе. Подробное описание ион-дрей- фового спектрометра, использованного в экспериментах, приведено в [15].

Регистрация экспериментальных данных и их обработка в комплексе ЖХ—ИДС позволяет проводить регистрацию отдельных спектров подвижности, их серию по времени, проводить для наглядности наложение единичных спектров подвижности с совмещением начала регистрации спектров, выделять интересующую область спектра подвижности и представлять в выбранном из меню программ обработки виде. Для полноценной работы с программами необходима операционная система MS Windows XP.

В экспериментах использовался микроколоноч-ный жидкостный хроматограф "Милихром А-02" и хроматографическая колонка с внутренним диаметром 2 мм, длинной 75 мм и с обращенной фазой типа "С18", диаметр зерна адсорбента 5 мкм (ЗАО Институт хроматографии "ЭкоНова", г. Новосибирск, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для определения аналитических характеристик ион-дрейфового спектрометра в качестве детектора жидкостного хроматографа при детектировании разделенной хроматографически смеси в режиме регистрации положительных ионов с электрорас-пылительным источником ионов проведены первые измерения тестового раствора, состоящего из полипептида бацитрацина А (10 аминокислотных остатков, молекулярная масса 1 421.74 Да) и смеси альфа и бета полипептидных субъединиц гемоглобина человека (141 и 146 аминокислотных остатков, молекулярные массы 15 258 и 15 998 Да соответственно).

Рис. 1. Хроматограмма тестовой смеси бацитрацина и гемоглобина с регистрацией УФ-детектором хроматографа на длине волны 214 нм

Рис. 2. Спектр подвижности бацитрацина на 787-й с от начала хроматографирования

Тестовая смесь приготавливалась следующим образом. К 10 мг сухих препаратов смеси субъединиц гемоглобина человека и 10 мг бацитрацина А добавили 650 мкл и 7 мл воды соответственно и получили их растворы с концентрацией 10–3 М каждого. В виалу для хроматографа отбирали 10 мкл раствора гемоглобина и 30 мкл раствора бацитрацина А. В качестве элюентов использовались ацетонитрил (элюент Б) и деионизованная вода (элюент А) с добавлением муравьиной кислоты до концентрации 0.1 %. Хроматографическое разделение проводилось в градиенте ацетонитрил—вода со скоростью потока 100 мкл/мин. Градиент от 5 % ацетонитрила до 30 % за 9 мин; с 9-й по 16-ю мин — изократиче-ский режим при 30 % ацетонитрила; а с 16-й по 17-ю мин градиент ацетонитрила с 30 до 50 %

Рис. 3. Спектр подвижности гемоглобина на 1290-й с от начала хроматографирования и с 17-й по 25-ю мин — изократический режим 50 %. На рис. 1 представлена хроматограмма тестовой смеси бацитрацина и гемоглобина с регистрацией УФ-детектором хроматографа на длине волны 214 нм. Время выхода бацитрацина — 787-я с от начала хроматографии, а гемоглобина 1 290-я с.

Для экспериментов по определению аналитических возможностей ион-дрейфового спектрометра в качестве детектора для жидкостного хроматографа выход хроматографической колонки напрямую подключался ко входу в элек-трораспылительный источник ионов, работающий при нормальных условиях. При вышеописанной хроматографической методике разделения тестовой смеси проводилась регистрация ионного тока во времени. На рис. 2 представлен спектр подвижности бацитрацина на 787-й с от начала хроматографии, а на рис. 3 спектр подвижности гемоглобина человека на 1290-й с, записанные в процессе детекции результатов хроматографического разделения. На рис. 4 представлены совмещенные по времени начала записи спектры подвижности, приведенные на рис. 2 и 3. Стоит отметить, что шкала времени на этих спектрах измеряется в микросекундах. Также программно выделяется часть совмещенных спектров подвижности, соответствующих пикам бацитрацина и гемоглобина человека, — на рис. 4 затенена. Выделенная на рис. 4 область совмещенных спектров подвижности, преобразованная в масштабе времени хроматографии — минуты (сотни секунд), — представлена на рис. 5, где пики по времени выхода соответствуют бацитрацину и гемоглобину человека в сравнении с УФ-детекцией на рис. 1.

Рис. 4. Совмещенные по времени начала записи спектры подвижности бацитрацина и гемоглобина

Рис. 5. Фрагмент хроматограммы тестовой смеси бацитрацина и гемоглобина, полученный из спектров подвижности отдельных веществ (рис. 4)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментально показаны возможности работы ион-дрейфового спектрометра с электрорас-пылительным источником ионов с динамическим делением потока распыляемого раствора при нормальных условиях в качестве детектора жидкостного хроматографа. Хроматографическое разделение проводилось при скорости потока 100 мкл/мин. Конструкция ион-дрейфового спектрометра проста в изготовлении, за исключением затвора Нильса—Бредбери, и позволяет проводить регистрацию хроматографического разделения в двух модах — положительной и отрицательной, что расширяет возможности спектрометра в качестве детектора хроматографа. Отдельного исследования требует определение предела детектирования, которого можно ожидать, исходя из определения параметров спектрометра [16], порядка 10–7– 10–8 г/мл. По сравнению с оптическими детекторами хроматографа нет влияния температуры и вибраций на стабильность и воспроизводимость работы прибора, отсутствуют источники света, имеющие ограниченный ресурс, и нет зависимости от используемого в детекторе спектрального диапазона при решении различных классов задач. Можно отметить, что ион-дрейфовый спектрометр в качестве детектора жидкостного хроматографа достаточно универсален по сравнению с оптическими: фотометрическим, ультрафиолетовым, рефрактометрическим, флуориметрическим и т. д. В ион-дрейфовом спектрометре отсутствует понятие "ячейка" в отличие от оптических детекторов. Кроме того, из комплекса ЖХ—ИДС легко конструктивно собрать комплекс ЖХ—ИДС—МС, где МС, желательно, — времяпролетный масс-спектрометр с интерфейсом для ортогонального ввода ионов с атмосферного давления в вакуум прибора; при этом легко достигается скорость записи спектров порядка 150 с–1, что вполне информативно.