Искусственные ассоциативные симбиозы между томатом и ризобиями, обладающими фунгистатической активностью

Работа проводилась при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (Госконтракт 16.740.11.0671, Соглашение 8115), РФФИ (Соглашения 12-04-31277, 12-04-31284).

выявлен их потенциал в качестве ассоциативных микросимбионтов для небобовых культур (9), в том числе для томата (10, 11). Для улучшения колонизации корней небобовых растений ризобиями применяются различные методы, в том числе используются трансгенные растения, синтезирующие вещества, которые участвуют в сигналинге на ранних этапах бобово-ризобиального симбиоза. К таким веществам относятся лектины — секретируемые белки, способные узнавать и избирательно связываться с разнообразными углеводами (12), в частности с полисахаридами на клеточных стенках ризобий, тем самым фиксируя микроорганизмы на поверхности корневых волосков (13). Ранее несколькими группами ученых проводились работы по изменению специфичности симбиоза с использованием лектинов бобовых растений (14-16). При этом бактерии обнаруживались как на внешней поверхности корней, так и во внутри- и межклеточном пространстве. Таким образом, корни растений, трансгенных по генам лектинов, потенциально будут специфично колонизироваться только ризобиями, которые выполняют полезные для растений функции, например защищают от фитопатогенов.

Почвенные бактерии Agrobacterium rhizogenes , несущие Ri-плазмиды, способны вызывать образование трансгенных «бородатых корней» у многих видов двудольных растений. «Композитные» растения с такими корнями, несущие целевые гены, используются для изучения взаимодействий растений с микроорганизмами, грибами и нематодами (17). В частности, «бородатые корни» томатов, в которых экспрессируется ген лектина гороха (18), могут стать хорошей моделью для изучения возможности защиты растений от патогенов через повышение эффективности ассоциативного симбиоза с ризобиями.

Цель настоящей работы заключалась в изучении возможности создания искусственных направленных ассоциаций бактерий с корнями сельскохозяйственных несимбиотрофных растений для их защиты от фитопа-тогенных грибов на примере томата ( Lycopersicon esculentum ) и клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum .

Методика . Объектом исследований был томат ( Lycopersicon esculentum ) сорта Дубок. Растения трансформировали с помощью штамма Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834, полученного из коллекции Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург), с ранее введенным вектором pCambia 1305.1, в который встроили ген лектина гороха посевного psl под контролем 358-промотора вируса мозаики цветной капусты (19). В работе также использовали штаммы бактерий, ассоциированных с корнями дикорастущих бобовых растений на территории Республики Башкортостан (коллекция Института биохимии и генетики Уфимского НЦ РАН).

Композитные растения томата получали способом, описанным в работе R. Collier с соавт. (17). Поверхность семян стерилизовали в течение 2 мин в 70 % спирте и затем 15 мин в 15 % растворе гипохлорита натрия с добавлением нескольких капель Tween 20. В эксперименте по трансформации растений использовали 2-суточные культуры A . rhizogenes (pCambia 1305.1- psl) и A . rhizogenes (исходный штамм), выращенные при 28 ° С в жидкой среде TY (дрожжевой экстракт — 0,1 %, бактотриптон — 1,0 %, CaCl₂ — 0,1 %) с добавлением канамицина (100 мг/л) и ацетосирингона 200 (мкМ) в первом случае и только ацетосирингона — во втором.

Перед пересадкой растений с «бородатыми корнями» в субстрат (простерилизованная смесь почвы и песка) и через 1 нед после пересадки проводили гистохимический анализ корней на gus-активность (20). Фраг- менты инкубировали в X-Gluc реактиве, содержащем 5-бром-4-хлор-3-ин-долил-р-П-глюкуронид (1 мг/мл), 0,5 % Тритон X-100, Na2EDTA (100 мМ), метанол (20 %), K3Fe(CN)6 (0,5 мМ), K4Fe(CN)6 (0,5 мМ) и Na-фосфатный буфер (50 мМ, pH 7,0) («Sigma-Aldrich», США). Корни выдерживали при 37 °С в течение ночи и выявляли наличие синего окрашивания.

При ПЦР-анализе ДНК из «бородатых корней» выделяли фенольно-хлороформным методом. Для обнаружения гена лектина psl в препаратах использовали праймеры (5 ' -ATAATGGCTTCTCTTCAA-ACCC-3 ‘ и 5 ' -GCAAAAAAACTATGCATCTGCA-3 ' ), фланкирующие участок этого гена, и стандартные наборы реактивов для амплификации («Helicon», Россия). ПЦР проводили на амплификаторе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия) по протоколу согласно рекомендациям производителя при оптимальной для указанной пары праймеров температуре отжига. Положительным контролем служила плазмида pCambia 1305.1- psl.

Для выявления бактерий-симбионтов с фунгистатической активностью провели скрининг изолятов с использованием в качестве тест-культур грибов Fusarium solan , F . oxysporum и Fusarium sp. из коллекции Уфимского государственного нефтяного технического университета, а также F . oxysporum f. sp. lycopersici (F-140) из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино). Фунгистатическую активность микроорганизмов оценивали методом двойной культуры. Бактерии высаживали крестом в центр чашки Петри, разделяя ее на четыре сектора. В середину каждого помещали кусочек агаризованной питательной среды с мицелием гриба. Чашки ставили в термостат и инкубировали при 27 ° С. Через 3 сут измеряли радиус колоний грибов в направлениях к бактериям (R 1 ) и к краю чашки (R₂) и вычисляли степень подавления роста грибов (T) по формуле T = (R₂ - R 1 )/R₂ х 100 % (21).

Видовую принадлежность бактерий определяли на основании анализа последовательности гена 16S-рРHК (22).

При проверке штаммов бактерий на синтез сидерофоров минимальную среду с CAS-реактивом (синий агар) готовили согласно описанию (23). Бактерии, выросшие на среде YM, пересаживали на синий агар и выращивали в течение 5 сут. Изменение окраски агара на желтую, оранжевую или розовую указывало на выделение сидерофоров. Для выявления синтеза цианида бактерии выращивали в чашках Петри в течение 1 сут на среде YM с добавлением глицина (4,4 г/л). После этого фильтровальную бумагу, пропитанную водным раствором 0,5 % пикриновой кислоты с 2 % Na₂CO₃, клали на крышки чашек Петри. Чашки обматывали пленкой Parafilm и инкубировали в течение 4 сут при 28 ° С. При выделении цианида окраска бумаги изменялась с желтой на оранжевую или коричневую из-за образования соли пикриновой кислоты (24).

Для совместной инокуляции растений бактериями и грибами получали суспензию спор F. oxysporum f. sp. lycopersici. Гриб выращивали в чашке Петри со средой YM в течение 5 сут. Затем его заливали 20 мл стерильной воды и ставили на ночь в холодильник. Число смытых спор подсчитывали в камере Горяева. Бактерии R. leguminosarum накапливали при 28 °С в течение 1 сут в жидкой среде YM до титра 107 КОЕ/мл. Корни растений помещали в полученную бактериальную суспензию на 1 сут. Затем их отмывали в стерильной воде, растения пересаживали в почву, содержащую 10 мл суспензии спор гриба (плотность — 105 шт/мл), и выращивали в течение 3 сут. После этого корни растений отмывали и окрашивали толуидиновым синим в течение 1 ч (гифы грибов приобретали фиоле- товую окраску, клетки растений — голубую), затем еще раз отмывали в цитратном буфере (25) и изучали с использованием микроскопа Axio Imager Ml («Carl Zeiss AG», Германия).

Результаты . После обработки растений A . rhizogenes «бородатые корни» начинали образовываться через 10-12 сут на 90 % растений (рис. 1). В течение 1-й нед появлялись придаточные корни, которые удаляли скальпелем.

А                           Б                 В

Рис. 1. Получение композитных растений томата ( Lycopersicon esculentum ) сорта Дубок после трансформации с помощью штамма Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834, несущего вектор pCambia 1305.1 со встроенным геном лектина гороха посевного psl под контролем 358-промотора вируса мозаики цветной капусты: А — растения в минеральной вате, Б — «бородатые корни» после 10 сут выращивания, В — «бородатые корни» после 3 нед выращивания.

Рис 2. ПЦР-анализ ДНК из «бородатых корней» композитных растений томата ( Lycopersicon esculentum ) сорта Дубок, полученных с использованием вектора pCambia 1305.1, на наличие гена лектина гороха посевного psl : 1 — ПЦР-продукт гена psl из «бородатых корней», 2 — ПЦР-продукт гена psl плазмиды pCambia 1305.1; М — маркер молекулярных масс 100 bp + 1.5 Kb + 3 Kb («Si-benzyme», Россия).

Через 2 нед корни проверяли на gus-активность, растения пересаживали в стерильную смесь почвы и песка и выращивали еще 1 нед. Gus-окрашивающиеся корни были обнаружены у 53 % растений. ПЦР-анализ ДНК из этих корней показал присутствие гена лектина (рис. 2).

Ранее нами были получены полностью трансгенные растения табака, а также химерные растения рапса и томатов, экспрессирующие ген лектина гороха (26-28). На таких растениях было обнаружено увеличение численности бактерий R. legumino-sarum 1078 соответственно в 37, 14 и 10 раз по сравнению с нетрансгенными растениями. Этот факт подтверждал взаимодействие ризобий с лектином на поверхности трансгенных корней. Колонизация корней бактериями с фунгистатической активностью при увеличении численности последних потенциально могла бы защитить растения от патогенов. В природе с R. leguminosarum наиболее часто вступают в симбиоз растения, относящиеся к трибе Vicea. Поскольку ранее в клубеньках у ряда дикорастущих растений были обнаружены ризобии с фунгистатической активностью (29), мы провели скри нинг коллекции бактерий, собранной на дикой растительности, которая относится к указанной трибе (30), для выявления штаммов, обладающих

подобными свойствами. Всего было исследовано 568 изолятов. Фунгиста-тическую активность в отношении исследуемых грибов обнаружили у семи штаммов (табл.).

Коэффициент торможения роста колоний (Т, %) у грибов рода Fusarium в присутствии природных изолятов бактерий-симбионтов диких растений из трибы Vicea

Микросимбионт	Fusarium sp.	F. oxysporum f. sp. lycopersici	F. solani	F. oxysporum
Rhizobium leguminosarum 116	17	41	65	70
Pseudomonas sp. 2	0	0	25	0
Pseudomonas sp. 102	40	29	53	53
Pseudomonas sp. 103	0	21	22	33
Pseudomonas sp. 15.2	0	13	17	19
Pseudomonas sp. 14M	0	25	19	25
Stenotrophomonas rhizophila	40	0	33	18

Видовую принадлежность штаммов бактерий подтвердил анализ последовательности гена 168-рРНК (данные не приведены).

Фунгистатическая активность бактерий может быть обусловлена секрецией сидерофоров — белков, способных образовывать комплекс с ионами железа, делая их недоступными для грибов, а некоторые штаммы ризобий выделяют цианид водорода (HCN), что оказывает отрицательное воздействие на рост грибов (2, 5). У изученных нами микросимбионтов способность синтезировать эти фунгистатические метаболиты была следующей (сидерофоры/цианиды): Rhizobium leguminosarum 116 — «+»/« - », Pseudomonas sp. 2 — «+»/« - », Pseudomonas sp. 102 — «+»/« - », Pseudomonas sp. 103 — « - »/«+», Pseudomonas sp. 14M — « - /+», Stenotrophomonas rhizophila — «+»/«+». То есть среди исследованных штаммов способность синтезировать сидерофоры была обнаружена у двух представителей рода Pseudomonas , у S. rhizophila и R. leguminosarum , а цианид выделяли два штамма Pseudomonas (14M и 103) и S. rhizophila . Таким образом, штаммы, обладающие наибольшей фунгистатической активностью ( R. leguminosarum 116 и Pseudomonas sp. 102), синтезировали сидерофоры, но не цианид. Следует, однако, отметить, что S. rhizophila, секретирующий оба этих вещества, имел не самые высокие показатели. Возможно, что фунгистатическая активность штаммов связана еще с какими-то механизмами (например, с синтезом антибиотиков).

Найденный в результате исследований штамм R. leguminosarum 116 с максимальной фунгистатической активностью в отношении F . oxysporum f. sp. lycopersici был использован в качестве микросимбионта в дальнейших экспериментах по созданию искусственных симбиотических ассоциаций.

После инокуляции композитных растений томата с трансгенными по гену лектина корнями (контроль — нетрансгенные растения) суспензией штамма R . leguminosarum 116 и их пересадки в почву, содержащую споры гриба F. oxysporum f. sp. lycopersici , световая микроскопия подтвердила (рис. 3, а-д), что обработка трансгенных по гену psl корней штаммом R . leguminosarum 116 уменьшает количество гиф патогена F . oxysporum f. sp. lycopersici в ризосфере (см. рис. 3, г). Такой же эффект, но в гораздо меньшей степени, наблюдался у контрольных растений, на корнях которых адсорбция ризобий происходила менее эффективно (см. рис. 3, в).

Ранее в ряде работ было показано, что Bradyrhizobium japonicum , Si-norhizobium meliloti и R. leguminosarum способны замедлять рост F . solani в опытах с подсолнечником и бамией (1), а S. meliloti и R . trifolii могут использоваться для биоконтроля F . oxysporum, заражающего подсолнечник и томат (31).

1 Рис. 3. Совместная обработка растений томата (Lycopersicon esculentum) сорта Дубок бактериями-симбионтами с фунгистатическими свойствами (Rhizobium leguminosarum) и патогенными грибами (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici): а — нетрансгенные растения + F. oxysporum f. sp. lycopersici; б — растения с корнями, трансгенными по гену ^ лектина гороха посевного psl + F. oxysporum f. sp. lycopersici; в — нен трансгенные растения + F. oxysporum f. sp. lycopersici + R. legumi-——————•         nosarum; г — растения с корнями, трансгенными по гену лектина го' мм               роха посевного psl + F. oxysporum f. sp. lycopersici + R. legumino sarum ; д — незараженные нетрансгенные растения (световая микроскопия (Axio Imager M1, «Carl Zeiss AG», Германия; окрашивание толуидиновым синим).

Итак, использование генов лектинов бобовых растений в качестве трансгенов позволяет создавать у несимбиотрофных растений, таких как томат, искусственные корневые ассоциации с ризобиями, обладающими фунгистатической активностью. Полученные результаты могут найти применение при создании искусственных ассоциативных симбиозов для биоконтроля фитопатогенов.