Использование цитоэмбриологических исследований в селекции ВНИИСПК (к 170-летию Научно-исследовательского института селекции плодовых культур ФГБ)

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур (ВНИИСПК) является старейшим помологическим учреждением по садоводству. В этом году институту исполняется 170 лет (официальная дата основания - 28 апреля 1845 года). За это время институт не менял своего основного помологического и селекционного направления исследований.

В настоящее время это одно из ведущих селекционных учреждений России – селекционный центр по плодовым культурам с большими научными достижениями, традициями и исследовательскими школами.

Основными направлениями научной деятельности ВНИИСПК в настоящее время являются: создание новых конкурентоспособных сортов плодовых и ягодных растений, пригодных для выращивания по современным интенсивным технологиям; разработка теоретических и методических основ создания новых форм плодовых и ягодных растений с использованием методов комбинативной селекции, полиплоидии и биотехнологии; мобилизация, сохранение и изучение мирового генофонда плодовых растений и их диких сородичей для использования в селекции; совершенствование имеющихся и разработка новых ресурсосберегающих технологий производства плодов, ягод и посадочного материала на базе новых сортов. Активно развиваются приоритетные направления селекции: селекция на морозо- и зимостойкость, на иммунитет и высокую устойчивость к болезням и вредителям, слаборослость и компактность габитуса, пригодность к механизированной уборке урожая, высокую самоплодность, улучшенный биохимический состав и вкусовые качества плодов, пригодность их к различным видам переработки и хранению, селекция на полиплоидном уровне и др. В институте создано около 180 сортов плодовых и ягодных культур, из которых 123 допущены к использованию. 52 сорта яблони, 8 сортов груши, 21 сорт вишни, 4 сорта черешни, 7 сортов сливы, 2 сорта абрикоса, 8 подвоев для вишни, 13 сортов смородины черной и 8 сортов смородины красной [1].

ВНИИСПК единственное в России учреждение осуществляющее исследования по получению триплоидных сортов яблони от целенаправленных скрещиваний с использованием доноров диплоидных гамет. Получение новых адаптивных триплоидных сортов – важное направление исследований в рамках программы по селекции яблони на полиплоидном уровне. Целенаправленная селекция яблони на полиплоидном уровне – принципиально новый и эффективный метод в селекции. Группой ученых под руководством академика Седова Е.Н. впервые в России и в мире получены триплоидные сорта (Масловское, Августа, Дарёна, Бежин луг, Орловский партизан и др.), отличающиеся повышенными адаптивными и хозяйственно ценными свойствами. Создано 21 (17 от разнохромосомных скрещиваний; 4 от скрещивания диплоидных сортов) новых триплоидных сортов, которые характеризуются регулярным плодоношением и высокой товарностью плодов. Часть новых сортов обладает иммунитетом к парше [2].

В проведении исследований по этому разделу, наряду с селекционерами, большую работу выполняет лаборатория цитоэмбриологии. Селекция яблони, как и других плодовых культур, на полиплоидном уровне невозможна без проведения цитоэмбриологического изучения как на этапе подбора и создания исходных форм, так и на этапе оценки полученных в результате гибридизации полиплоидных сортов и гибридов. Таким образом, в связи с необходимостью осуществления постоянного цитоэмбриологического контроля полиплоидных исходных форм в 1976 году во ВНИИСПК была создана цитологическая лаборатория под руководством заведующей лабораторией, доктором с.–х. наук Г. А. Седышевой [3]. В настоящее время лаборатория цитоэмбриологии - практически единственная в России лаборатория, занимающаяся подобными видами исследований. В практике селекционных работ с плодовыми культурами применение цитологических исследований имеет важное значение в решении вопросов плодоводства. Зная особенности формирования микро-и макроспор, можно достаточно точно охарактеризовать качество формирующихся гамет (мужских и женских). Последнее дает возможность селекционеру осознанно подойти к вопросам постановки генетико-селекционных опытов, к выбору конкретных методов исследований, подбору исходных форм, определению сроков и нужного объема скрещиваний, чтобы получить достаточное количество гибридного материала для последующего изучения и отбора хозяйственно-ценных форм.

Анализ плоидности у гибридных сеянцев, полученных от разнохромосомных скрещиваний, позволяет выявить выход триплоидных растений, что также имеет большое значение для выделения в дальнейшем новых ценных сортов яблони.

Исследование мейоза в пыльниках при работе с плодовыми позволят изучить характер редукционного деления и предсказать фертильность или стерильность гибрида.

Изучение развития, строения и прорастания пыльцы на искусственной среде и на рыльцах пестика помогает определять качество пыльцы и тем самым выявить лучшие сорта - опылители. Изучение картин деления первичного ядра пыльцевых зерен позволяет установить числа хромосом в гаметах, образующихся в редукционном делении.

Изучение женского гаметофита, его развития, а также строения семяпочки и зародышевого мешка помогает установить насколько эти процессы протекают нормально и позволяют определить перспективность сорта как производителя плодов и семян, что важно при использовании его в качестве материнской исходной формы.

В лаборатории цитоэмбриологии ведется систематическая инвентаризация уровня плоидности коллекции исходных форм, гибридного потомства от интервалентных скрещиваний разного типа (диплоид × тетраплоид, тетраплоид × диплоид и др.). За весь период работы проанализирована плоид ность около 700 сортообразцов коллекционных сортов, исходных форм, элитных и отборных сеянцев яблони. Определена плоидность гибридного потомства более 430 семей от разнохромосомных скрещиваний типа диплоид × тетраплоид, диплоид × триплоид, триплоид × тетраплоид, триплоид × диплоид, тетраплоид × диплоид, тетраплоид × триплоид и тетраплоид × тетраплоид общим объемом более 14,5 тыс. растений. Установлено, что наиболее эффективным способом массового получения триплоидов с целью отбора среди них хозяйственно ценных форм является скрещивание тетраплоидов с диплоидами. В среднем по всем комбинациям скрещивания типа диплоид × тетраплоид формируется 69,5%, а в скрещиваниях типа тетраплоид × диплоид 55, 1% триплоидных растений [4]. Чтобы увеличить выход триплоидных сеянцев необходимо учитывать степень самоплодности тетраплоидных форм, взятых в качестве материнского компонента. Например, низкий выход триплоидных и высокий процент тетраплоидных сеянцев в комбинации, где тетраплоид 30-47-88 использован в качестве материнской формы, обусловлен высокой самоплодностью этой формы: при опылении некастрированных цветков этой формы пыльцой диплоидных сортов на рыльце предпочтительно прорастала собственная пыльца. В комбинации скрещивания 30-47-88 (4х) х Краса Свердловска (2х) из 85 растений 5 растений (5,9%) имели триплоидный набор хромосом, 80 (94,1%) – тетраплоидный. Чтобы повысить выход триплоидных сеянцев в комбинациях скрещивания, где форма 30-47-88 (4х) является материнским родителем, необходимо производить кастрацию цветков. Количество же триплоидных сеянцев с участием в качестве опылителя формы 30-47-88 (4х) высокое (от 59,2% до 100%) [5].

Одно из направлений исследований лаборатории цитоэмбриологии ВНИИСПК -всестороннее изучение эмбриональных структур тетраплоидных форм яблони -доноров диплоидных гамет.

К настоящему времени подробно изучен ход мейоза при микроспорогенезе и формирование микроспор у 18 тетраплоидных форм яблони, формирование женского гаметофита у 12 исходных форм.

При сравнении между собой тетраплоидных форм яблони отмечены общие у них морфологические типы нарушений на всех стадиях микроспорогенеза. Так, на стадиях метафазы-I и II наиболее распространенными типами нарушений являются преждевременное забегание отдельных хромосом к полюсам веретена деления, выброс за пределы ахроматинового веретена, сверхчисленные веретена, часто встречаются микроспороциты с двумя и даже тремя типами нарушений одновременно в одном микроспороците (забегания + выброс и др.), асинхронное деление в разных веретенах. На стадии анафаза-I и II чаще других типов встречаются выбросы и запоздалое деление (отставание) части бивалентов в центре веретена деления, мосты и комбинации из двух типов нарушений в одном микроспороците одновременно, например, отставание + выбросы. Стадия телофаза-I и II характеризуются, в основном, наличием микроядер и сверхчисленных ядер. Часть таких нарушений приводит к формированию спорад с числом микроспор больше или меньше нормы. У подавляющего большинства тетраплоидных форм на стадии тетрад встречаются полиады с числом микроспор от 5 до 7, пентады, гексады, гептады, реже встречаются октады и нонады, а также диады и триады. Несмотря на значительное число нарушений микроспорогенеза, у большинства изученных форм мейоз завершается формированием значительного количества морфологически нормальной одномерной пыльцы. Изредка отмечены крупные пыльцевые зерна.

Макроспорогенез и формирование женского гаметофита у тетраплоидных форм сопровождаются некоторым количеством аномалий на разных этапах. Тем не менее, к началу цветения у всех изученных форм отмечено достаточное количество нормально сформированных зародышевых мешков, готовых к оплодотворению. Большинство изученных форм пригодны для использования в качестве материнских форм в скрещиваниях типа 4х х 2х [6]. На основании полученных данных в качестве доноров диплоидных гамет наиболее эффективными зарекомендовали себя сорта и формы: Уэлси тетраплоидный (2-4-4-4х), Джаент Спай (2-4-4-4х), 13-6-106 (сеянец сорта Суворовец) (4х), Папировка тетраплоидная (2-4-4-4х), Антоновка плоская (2-4-4-4х), 2537-45 (4х), 25-35-120 (4х), 25-35-144, Мелба (4х), Спартан (4х), 20-9-27 (4х), 25-37-47 (4х), 30-47-88 (4х). Особенно уникален донор диплоидных гамет 30-47-88 (4х), характеризующийся иммунитетом к парше. Использование его открывает большие возможности для создания адаптивных триплоидных сортов, иммунных к парше, способных давать экологически безопасную продукцию, что способствует повышению конкурентоспособности отечественной садоводческой продукции.

На основе отдаленной гибридизации с включением в селекционный процесс диплоидных видов во ВНИИСПК в лаборатории селекции косточковых культур доктором наук Джигадло Е. Н. получены доноры устойчивости к таким вредоносным заболеваниям косточковых культур, как коккомикоз и монилиоз. С помощью цитологических методов проанализирована плоидность полученных гибридов в том числе и отдаленных, изучены особенности формирования и качества мужских гамет у этих форм для определения возможности использования их в селекции для получения сортов вишни, устойчивых к данным заболеваниям.

Изучены микроспорогенез и формирование мужского гаметофита у 12 отдаленных гибридов вишни, женского гаметофита у 4 форм.

Установлено, что из тетраплоидных отдаленных гибридов наиболее правильным ходом мейоза отличается гибрид 82990 [Памяти Вавилова х 12-1а-320 (2822 х в. сахалинская)]. Число нарушений у него меньше, чем у других гибридов, а количество нормальных микроспороцитов на разных стадиях мейоза, соответственно, больше и составляет от 65,6 до 92,1%.

Более нарушенный мейоз характерен для тетраплоида 83187 (Памяти Вавилова х C. lannesiana № 1), процент аномальных клеток составляет от 20,9 до 68,5%, в зависимости от стадии деления. Каждой стадии мейоза присущи отклонения от нормы, общие для всех изученных гибридов вишни. Реже встречаются специфические нарушения: в метафазе-I наблюдали единичные случаи, когда микроспороцит был безъядерным, т. е. хроматин полностью отсутствовал (82990), диффузное размещение ассоциаций хромосом по всему микроспороциту; в анафазе-I расщепление веретена у гибрида 83187; на стадии телофаза-I у формы 85017 был зафиксирован микроспороцит, содержащий одно ядро, асинхронное развитие ядер – у гибрида 85023; метафаза-II – наличие трех фигур деления вместо обычных двух (83187, 85017 [Любская (Cerasus vulgarus Mill.) х в. Максимовича]), которые образуются из групп хромосом, выброшенных в процессе первого деления в цитоплазму микроспороцита или появляющихся в результате расщепления веретена; в анафазе-II сверхчисленные фигуры деления отмечены у гибрида 85023; на стадии телофаза-II наблюдали микроспороциты с двумя крупными ядрами (82990, №3 (в. Любская х в. Максимовича – свободное опыление)), из которых в дальнейшем образуются диады. У гибрида № 3 отмечали единичные случаи дегенерации хроматина.

Триплоидный гибрид 85023 (Любская х в. Максимовича) из-за несбалансированности числа хромосом (2n = 3х = 24), в отличие от тетраплоидов, характеризуется максимальным числом отклонений от нормы на всех стадиях микроспорогенеза. У него нарушена конъюгация хромосом, а также ход мейоза. Число нарушений на разных стадиях варьирует от 43,3% (стадия тетрад) до 80,2% (анафаза-I). Среди нарушений, которые обычно встречаются у полиплоидных форм и у отдаленных гибридов, у данной триплоидной формы в ходе мейоза наблюдаются микроспороциты, представляющие собой ценоцитные образования, с увеличенным числом фигур деления (например, шесть веретен нормально развитых на стадии метафазы-II или гигантские микроспороциты неправильной формы на стадии телофазы-II, число ядер у которых может достигать до 20). Крупные конгломераты на разных стадиях мейоза наблюдали также и у отдаленного тетраплоидного гибрида 85017, что предположительно является следствием нарушения цитокинеза еще на стадии формирования вторичного археспория у отдаленных гибридов [7].

У триплоидных гибридов с разной плодовитостью формируется разное количество сбалансированных гамет. У частично плодовитой формы 85023 гаметы с n=2х=8 составляют 18,6%, гаметы с n=2х=16 – 4,7%. У плодовитой формы 1а-320 [селекционный № 65628 (№2822 х C. sachalinensis №1)] формируется около 5% гамет с гаплоидным числом хромосом, около 2% с диплоидным числом хромосом и 0,7% нередуцированных (n=3х=24) гамет. Неплодовитый триплоидный гибрид 1а-298 [селекционный № 65645 (№2822 х C. Sachalinensis №1)] формирует в 100% случаев несбалансированные по числу хромосом гаметы. Форма 74342 (Любская х C. sachalinensis Edwin Muller) также характеризуется наличием сбалансированных гамет: гаплоидных – 6,7% и диплоидных – 3,3%. В связи с этим частично плодовитые триплоидные формы представляют интерес для включения их в селекцию, что находит практическое подтверждение [8].

Анализ микроспорогенеза плодовитого пентаплоидного гибрида (Cerasus vulgaris х Pr. Serrulata) показал, что среди анеуплоидных гамет (80%) встречаются нормальные гаплоидные (1,3%), диплоидные (8,1%) и триплоидные (1,9%).

Гексаплоидная форма 3-66-9 (в. степная х смесь сортов в. обыкновенной)

несмотря на нарушения в микроспорогенезе образует около 50% гамет со сбалансированным числом хромосом.

Исследованные формы продуцируют гетероплоидные гаметы и, как носители признаков устойчивости к коккомикозу и монилиозу представляют несомненный интерес для селекционных целей в качестве источников большого генетического разнообразия при получении форм вишни устойчивых к данным заболеваниям.

Таким образом, благодаря многолетней комплексной работе селекционеров и цитоэмбриологов, ведущейся во ВНИИСПК, получены практические результаты в селекции на полиплоидном уровне и отдаленной гибридизации ведущих плодовых культур – яблони и вишни.