Использование ДНК маркеров для изучения цитоплазматической мужской стерильности лука репчатого (Allium cepa L.)

Ядерно-цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) наряду с самонесовместимостью и протандрией являются природными феноменами, обеспечивающими перекрестное опыление в сортопопуляциях лука репчатого. В результате поддерживается гетерозиготность популяции и предотвращается инбредная депрессия. Несмотря на это частота самоопыления в популяциях сортов лука репчатого доходит до 25%, вследствие чего инбредная депрессия может достигать 30% [1]. В сельскохозяйственном производстве ЦМС лука репчатого используется для обеспечения 100% гибридности F1 промышленных семян. В сортах белорусской селекции Ветразь и Скарб литвинов мужская стерильность самоподдерживается в популяциях и ежегодно проявляется у 10-20% особей. В ходе создания гибридов F1 наиболее время-, трудо-, ресурсо- затратным процессом является выделение поддерживающих мужскую стерильность форм и создание на их основе выровненных инбредных линий.

Согласно классификатору СЭВ у лука репчатого встречаются два типа стерильности: 1 – ЦМС 1 тип Jones, Clark (1943) и 2 – ЦМС – 2 тип Beringer (1965) [2]. В работе Jones, Clark (1943) говорится об особенностях наследования ЦМС S-типа, в работе Beringer (1965) – о T-типе. Однако различия мужски стерильных фенотипов указанных цитотипов не описаны. В связи с этим пока невозможно различить фенотипически мужски стерильные растения растения S- и T-цитотипов. Это усложняет отбор исходных растений для гибридной селекции на основе ЦМС.

В начале нынешнего столетия в США, Японии и Китае были разработаны молекулярные маркеры ЦМС лука репчатого. Наибольшее внимание уделено изучению наиболее простого S-типа ЦМС, так как он проявляется при сочетании двух мутантных аллелей – одного ядерного и одного цитоплазматического. Молекулярная идентификация ЦМС форм позволяет существенно снизить число индивидуальных скрещиваний со стерильным тестером для идентификации поддерживающего генотипа за счет исключения отцовских растений с S-цитоплазмами и доминантными Ms-аллелями из тесткроссов.

На постсоветском пространстве работы по изучению молекулярных методов маркирования ЦМС были начаты в Российской Федерации [3, 4]. Наиболее изучены S- и T-типы ЦМС лука репчатого. Генетическая основа ЦМС-S, выявленной в 1925 году у сорта Italian Red, представляет собой взаимодействие вызывающей стерильность цитоплазмы (S) и ядерного восстановителя, представленного двумя аллелями Ms и ms [5]. T-цитоплазма была открыта в 1960 году во французском сорте Jaune Paille de Vertus. Термолабильная фертильность растений с Т-цитоплазмой восстанавливается двумя независимыми системами восстановителей. Первая система состоит из одного локуса А с двумя аллелями. Вторая состоит из двух действующих комплементарно локусов В и С. Фертильность восстанавливается доминантными аллелями всех систем [6].

В выполненной нами работе типы цитоплазмы определяли по полиморфизму митохондриальных orfA501 и cob генов [3]. Маркер orfA501 дает фрагмент молекулярной массой 473 п.о. у Т-цито-плазм, индуцирующих стерильность, в отличие от N-цитоплазмы [7]. S-цитоплазма отличается от T-цитоплазмы с помощью маркера cobS , дающего фрагмент массой 414 п.о. у S-цитоплазмы [8]. N-цитоплазма отличается от S- по cobN маркеру наличием продукта амплификации 180 п.о. Изучали маркеры, косегре-гирующие с ядерными аллелями Ms и ms , для отбора поддерживающих мужскую стерильность генотипов [9].

Материалы и методы

Использовали острые сорта лука репчатого белорусской селекции. Сорт Ветразь – скороспелый, среднегнездный, образующий 2-5 луковиц, выращиваемый через севок. Сорт Скарб литвинов может выращиваться в однолетней культуре из семян и в двухлетней культуре через севок. Сорт среднеспелый, одногнездный, образующий 1-2 луковицы. Также исследовали сорта и гибриды из коллекции института: Темптейшн F 1 , Марко F₁, Маргит F₁, Братко F₁, Хай белл F₁, Пандеро F₁, Хилтон F₁, Центро F₁, Робот, Тареско F₁, Франциско F₁, Премито F₁, Прометей, Эдельвейс, Аренал F 1 , Венто F 1 , EX07714593 F 1 , Кремень, Сабросо F₁, Универсо F₁, Бонус F₁, Велингтон F₁, Фирмо F₁, Ред цепелин F₁, Экстаз, Моушен F₁, Сангро F1, Балдито F₁, Навигатор, Визион F₁, Нерато F₁, Дормо F₁, Радимич, Беннито F₁. Опытные популяции лука репчатого выращивали в овощном севообороте РУП «Институт овощеводства» в Республике Беларусь, Минском районе, агрогородке Самохваловичи. Проводили инбридинг фертильных N-цитотипов и тесткроссы мужски стерильных S-цитотипов под индивидуальными изоляторами (рис. 1, a). В исследованиях использовали семьи сортов Ветразь и Скарб литвинов, полученные с цитотипированных растений (рис. 1, b, c).

ДНК выделяли из высечек Ø 0,5 см одной, двух запасающих чешуй маточной луковицы или из листьев наборами реагентов, выпускаемыми ГНУ «Институт биоорганической химии НАН Беларуси», в колонках связыванием на нейлоновой мембране.

Праймеры для orfA501 это 5’-ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC-3’ и 5’-CCAAGCATTTGGCGCTGAC-3’, соответствующая температура отжига 60 ° С [7]. Праймеры для региона митохондриального гена cob S-цитоплазмы 5’-GTCCAGTTCCTATAGAACCTATCACT-3’ (рис. 2, a). Для N-цитоплазмы 5’-TCTAGATGTCGCATCAGTGGAATCC-3’. Общий обратный праймер для cob S- и N-5’-CTTTTCTATGGTGACAACTCCTCTT-3’, температура отжига 53 ° С [8]. Олигонуклеотиды синтезированы ОДО

Рис. 1. Внешний вид индивидуальных изоляторов для соцветий лука репчатого (a), генотипированные семенные растения лука репчатого, транспортируемые для дозаривания и обмолота (b), семенные растения лука репчатого, выращенные из генотипи-рованных растений (с), d – контрольные растения лука репчатого.

Fig. 1. Appearance of cages used to obtain selfs on individual inflorescences of onion bulb selections (a), genotyped onion seed plants, transported for ripening and harvesting of seeds (b), onion seed plants grown from genotyped plants (c), d-control onion plants.

Рис. 2. Образцы электрофоретического анализа продуктов ПЦР тотальной ДНК образцов лука репчатого с использованием молекулярно-генетических маркеров. M1000 – маркер молекулярного веса 1000 п.н., a – молекулярный маркер cob S, положительные образцы на дорожках 1, 2, (414 п.о.); b – маркер ms, положительные образцы на дорожках 1, 3, 4, (357 п.н.); c – маркер Ms, положительный образец на дорожке 7 (566 п.н.). Продукты ПЦР цитоплазматических аллелей видны более четко, чем ядерных.

Fig. 2. Samples of electrophoresed products of PCR of total DNA of onion plants using molecular-genetic markers. M1000 - molecular weight marker 1000 bp, a - molecular marker cob S, positive samples on lanes 1, 2, (414 bp); b - marker ms, positive samples on lanes 1, 3, 4, (357 bp); c - Ms marker, positive sample on track 7 (566 bp). The PCR products of the cytoplasmic alleles are seen more clearly than the nuclear ones.

«Праймтех», Минск. Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 µl содержала 50 ng матричной ДНК, 1x«АМ» буфер для Tag-полимеразы «Праймтех», 0,2 mM каждого из dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 единицу Tag полимеразы и 10 ρ M каждого праймера. После периода начальной денатурации 94 ° С 2 мин., выполняли 25 циклов: 94 ° С - 30 сек., 60 (53) ° С - 1 мин., 72 ° С -2 мин. Терминальная элонгация 72 ° С - 5 мин.

Праймеры для идентификации Ms, ms аллелей синтезированы согласно [9]. Для детекции аллеля Ms прямой праймер – 5’-TACAGATTTGTTTATCTTCTTCTTCTTCT-3’, обратный – 5’-TTCATTTGTTAGGATGTACTCTTACC-3’, для аллеля ms прямой праймер – 5’-TCAGTATCAATAGAAGGAATCAC-3’, обратный – 5’-GTATACCATTGGTACTTGATGCA-3’ (рис. 2. b, c). Реакционная смесь общим объемом 25 µl содержала 50 ng матричной ДНК, 1x«АМ» буфер для Tag-полимеразы «Праймтех», 0,2 mM каждого из dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 единицу Tag-полимеразы и 10 ρ M каждого праймера. Условия ПЦР следующие: начальная денатурация 95 ° С - 6 мин, затем 35 циклов 95 ° С 30 - сек, 58 ° С - 45 сек, 72 ° С -45 сек. Терминальная элонгация 72 ° С -5 мин. Амплифицированные продукты ПЦР анализировали в 1% агарозном геле, визуализировали в UV-свете после окрашивания бромистым этидием.

Результаты и обсуждение

В связи с тем, что S-цитотип рекомендуется использовать в селекционной работе по ЦМС лука репчатого как более простой, анализ начали с cobS аллеля. В наших исследованиях с 2014 по 2018 годы нормальная N-цитоплазма выявлялась у всех растений сорта Ветразь, S-цитоплазма выявилась единично только в 2017 году. В популяции сорта Скарб литвинов S-цитоплазма встречалась ежегодно примерно у четверти растений. У некоторых растений сорта Скарб литвинов с S-цитоплазмой маркер N-отсутствовал. Первоначально фенотип мужской стерильности у сорта Скарб литвинов был классифицирован S-типом.

Наличие одновременно аллелей S- и N- в одной цитоплазме может объяснять частичное восстановление мужской фертильности у соответствующего фенотипа. В работе Kim [10] отражается тот факт, что растительные митохондриальные геномы в ходе эволюции увеличились в размерах и превратились в нестабильные структуры, по сравнению с компактными циркулярными структурами животных. Реаранжировки в растительной митохондриальной ДНК происходят под влиянием ядерных генов и других факторов и приводят к появлению химерных последовательностей. Продукты экспрессируемых химерных генов часто ухудшают митохондриальные функции, что приводит к таким морфологическим изменениям как мужская стерильность. Сообщается, что в геноме ЦМС-S цитотипа произошла интеграция последовательности хлоропластного гена ycf2 в митохондриальный геном [11]. Там же показано, что у лука репчатого происходят существенные перестановки митохондриальной ДНК между нормальным и ЦМС-S цитотипами.

В ходе исследований постоянно наблюдали фенотипы мужской стерильности лука репчатого при отсутствии S-маркера. Поэтому провели анализ маркеров T-цитотипа. В нашем эксперименте количество растений с Т-цитоплазмой у сорта Ветразь составляло 33,3%, у сорта Скарб литвинов – 25%. Наличие фрагмента orfA501 одновременно с фрагментами S и N- у некоторых индивидуальных растений Скарб литвинов отражает факт сосуществования S-, T- и N-факторов в одной цитоплазме. На основе этих результатов сделан вывод, что мужская стерильность у сорта Ветразь может быть классифицирована как Т-тип, а у сорта Скарб литвинов как сложная ЦМС на основе двух типов Т- и S-.

Существует мнение, что большинство мировых гибридов F 1 лука репчатого произведены на основе ядерно-цито-плазматической стерильности S-типа. Однако тестирование соответственных молекулярно-генетических маркеров мужской стерильности в 2017 году в коллекционном питомнике маточных растений показало наличие маркера S-типа цитоплазмы только у 22% образцов из мировой коллекции сортов и гибридов F₁ (Медуза F₁, Братко F₁, Хай белл F₁, Прометей, Эдельвейс, EX07714593 F 1 , Кремень, Велингтон F₁, Ред цепелин F₁). Единообразие маркера S-цитоплазмы установлено в 19% популяций. Ядерный аллель ms, отвечающий за мужскую стерильность особей с S-цитоплазмой, отмечен в гомозиготном состоянии у двух из исследованных иностранных образцов: EX07714593 F 1 и Медуза F 1 . Согласно нашим результатам, степень родства цитоплазм изученной коллекции единичному растению, источнику ЦМС S-типа, выделенному около века назад из короткодневного сорта Italian Red, далека от описываемых в научной литературе [12, 13] величин.

В 2018 году генотип, по теории поддерживающий мужскую стерильность – msmsN, выявлен у 10% растений сорта Ветразь, у 15% – у сорта Скарб литвинов. Растения, с генотипом тестера мужской стерильности – msms S выделены только из сорта Скарб литвинов. Эти результаты в сопоставлении с данными других лет отражены в таблице. Было показано, что часть растений в обоих сортопопуляциях не содержат ни одного из ядерных аллелей стерильности Ms/ms.

Фенотипическое выделение мужски стерильных тестеров в наших опытах пока является субъективным. В коллекции лука репчатого выявили полиморфизм по цвету пыльников, по особенностям антезиса. У контрольных фертильных растений сорта Ветразь пыльники желтого цвета, крупные, хорошо выполнены, при созревании раскрываются и

Таблица. Встречаемость растений с целевыми генотипами по годам, % Table. Occurrence of plants with target genotypes by years, %

Образец msmsS msmsN 2015 2016 2017 2018 2015 2016 2017 2018 Ветразь 0 0 5,0 0 29,2 25 27 10,0 Скарб литвинов 4,2 41,7 0 22,0 33,3 8,3 8,7 15,0 чатого молекулярное маркирование S-цитотипа позволило сократить число инбредных популяций и семей, полученных из мужски стерильных фенотипов. Среди отобранных семей ведется отбор на семенную продуктивность, на всхожесть, на нормальный рост и развитие особей в популяции. В результате были отобраны семьи на N-цитоплазме со всхожестью семян биологического урожая выше 70% из сортов Ветразь, Скарб литвинов и образцов Премито F1, Хилтон F1, Венто F1, Фирмо F1, Сабросо F1, Франциско F1, Тареско F1, Дормо F1, Аренал F1. Нами установлено, что большинство изученных генотипов c аллелем ms в гомозиготном состоянии характеризуются низкой всхожестью и слабым ростом.

Заключение или выводы

В результате исследований показано, популяция сорта белорусской селекции Ветразь состоит из цитоти-

легко высвобождают пыльцу. У цветков фенотипически мужски стерильных растений образца Медуза F1 (msmsS) пыльники усыхают до антезиса. У образца Темптейшн F1 (--N) пыльники отламываются до начала созревания. Все растения сорта Прометей (Ms-SN) имеют пыльники темно-зеленого цвета. У сорта Кремень (Ms-S) пыльники у мужски стерильных растений окрашены в коричневый цвет. У растений других образцов наблюдали пыльники крупные, выполненные, растрескивающиеся, но имеющие липкую, плохо высвобождающуюся пыльцу. В связи с этим наряду с молекулярно-генетическим скринингом выборки из открытоопыляемой популяции проводится контроль стабильности мужской стерильности по годам у клонов материнских растений и оценивается закрепление мужской стерильности последовательными тесткроссами.

На данном этапе исследовательской работы по гибридной селекции лука реп- пов ТN- и N-, то есть мужская стерильность сорта Ветразь относится к T-типу. Сортопопуляция Скарб литвинов состоит из композиции выявленных цитотипов: S-, SN-, SNT- и N. Мужская стерильность у сорта Скарб литвинов обусловлена цитоплазматическими аллелями S- и T-. В обоих сортах: Ветразь и Скарб литвинов выявлены источники ядерного локуса ms закрепляющего мужскую стерильность S-типа. По нашим результатам аллели Ms и ms отсутствуют в генотипах части растений в популяциях сортов Ветразь и Скарб литвинов. Отмечена низкая всхожесть и слабый рост большинства семей c аллелем ms, поэтому требуется проводить дополнительные инбридинги и отборы для получения гомозиготных ms растений, закрепляющих ЦМС S-типа. В коллекции иностранных сортов и гибридов различного происхождения выявлено 22% образцов с маркером ЦМС S-типа.

• • Литература

  • 1.    Gokcё A.F., Havey M.J./Selection at the Ms locus in open pollinated onion (Allium cepa L.) populations possessing S-cytoplasm or mixtures of N- and S-cytoplasms//Genetic Resources and Crop Evolution. – 2006. – № 53. – С.1495-1499.

  • 2.    Широкий унифицированный классификатор СЭВ и международный классификатор СЭВ лука репчатого (Allium cepa L.). Оломоуц, ЧССР, 1980. – С.17.

  • 3.    Супрунова Т.П., Логунов А.Н., Логунова В.В., Агафонов А.Ф./Определение типа цитоплазматической мужской стерильности лука репчатого (Allium cepa L.) селекции ВНИИССОК с помощью молекулярных маркеров//Овощи России. – 2011. – №4 (13). – С.20-22.

  • 4.    Пивоваров В.Ф., Пышная О.Н., Гуркина Л.К./Краткие итоги научных исследований по селекции и семеноводству овощных культур во ВНИИССОК//Овощи России. – № 4, (21). – 2013. – С.10-15.

  • 5.    Davis, E.W./The distribution of the male sterility gene in onion//Proc. Am. Soc. Hort. Sci. – 1957. – № 20. – Р.316-318.

  • 6.    Berninger E./Contribution a l'etude de la sterilite male de l'oignon (Allium cepa L.)//Ann Amelior Plant (Paris). – 1965. – № 23. – Р.183-199.

  • 7.    Enkle T., Terefe, D., Tatlioglu A./PCR-based marker system monitoring CMS-(S), CMS-(T) and (N)-cytoplasm in the onion (Allium cepa L.)//Theor. Appl. Genet. – 2003. – № 107. – P.162-167.

  • 8.    Sato Y./PCR amplificacion of CMS-specific mitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes in onion (Allium cepa L.)//Theor. Appl. Genet. – 1998. – № 96. – P.367-370.

  • 9.    Yan Yan Yang, Yu Meng Huo, Jun Miao, Bing Jiang Liu et al./Identification of two SCAR markers co-segregated with the dominant Ms and recessive ms alleles in onion (Allium cepa L.)// Euphytica. – Apr. 2013. – Vol. 190. – Is. 2. – P.267-277.

  • 10.    Kim S., Bang H., Patl B.S./Origin of three characteristic onion (Allium cepa L.) mitochondrial genome rearrangements in Allium species//Scientia Horticulturae. – 2013. – № 157. – Р.24-31.

  • 11.    Kim S., Yoon M./Comparison of mitochondrial and chloroplast genome segments from tree onion (Allium cepa L.) cytoplasm types and identification of a trans-splicing intron of cpx2//Curr. Genet. – 2010. – № 56. – Р.177-188.

  • 12.    Havey M./Cytoplasmic determinations using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion//Theor. Appl. Genet. – 1995. – № 90. – Р.263-268.

  • 13.    Havey M./Diversity among male-sterility-inducing and male-fertile cytoplasms of onion// Theor. Appl. Genet. – 2000. – № 101. Р.778-782.