Использование ДНК маркеров в селекции свиней

признаков . [2]. Целый ряд анализов доступен для коммерческого использования в России и за рубежом . В свиноводстве используют маркеры , связанные с качеством мяса (HAL1843 (CRC1), RN, CAST), размером приплода / плодовитостью (ESR, PRLR, RBP4), окраской (KIT, MC1R), параметрами роста и содержанием жира (MC4R, AFABP, HFABP, IGF2), устойчивостью к болезням (FUT1) и др . [2]. Большой вклад в развитие ДНК диагностики хозяйственно ценных признаков у свиней сделан в нашей стране специалистами Центра биотехнологии и молекулярной диагностики Всероссийского ГНИИ животноводства академиком РАСХН Л . К . Эрнстом , Н . А . Зиновьвой , Е . А . Гладырь [3, 4].

Для оказания помощи свиноводческим предприятиям Орловской области лаборатория генетики Инновационного научноисследовательского испытательного центра ОрёлГАУ освоила методы выявления полиморфизма четырех генетических систем: гена рецептора меланокортина 4 (MC4R), гена эстроген рецептора (ESR), гена рианодин рецепторного белка (RYR-1) и гена белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP). При освоении методов в нашей лаборатории ряд из них был оптимизирован с учётом новых научных данных и рекомендаций.

Цель данной публикации – ознакомить специалистов с протоколами методик , оптимизированных в нашей лаборатории , и показать практикам возможности интенсификации селекционного процесса по хозяйственно ценным признакам в их хозяйствах .

Материалы и методы исследований

Материалом для исследования служили свиньи породы крупная белая , любезно предоставленные ГНУ Тульский НИИСХ РАСХН .

Генотипирование проводили методом ПЦР - ПДРФ - анализа ( табл . 1). ДНК выделяли из крови животных , используя набор DIAt о m DNAPrep ( Биоком , Россия ).

Амплификация была выполнена с помощью набора GenPak PCR Core ( Биоком , Россия ) на приборе MyCycler (BioRad, СШ А ).

Оптимизация методик заключалась в подборе параметров проведения амплификации , в частности – температуры отжига праймеров , подборе параметров проведения рестрикции и визуализации продуктов в геле .

Результаты и обсуждение

Рецепторы эстрогена играют важную роль в метаболизме млекопитающих . В связи с этим гены , кодирующие рецепторы эстрогена рассматриваются как потенциальные маркеры репродуктивных и функциональных признаков [5]. По литературным данным , Pvu II полиморфизм гена эстроген рецептора (ESR) достоверно ассоциирован с размером приплода [6,7]. Эффект варьирует от 1,15 свиней на приплод у китайской породы Мейшан (Meishan synthetics) до 0,42 свиней на приплод у крупной белой породы . Кроме того , увеличение среднего размера приплода наблюдается у пород , произошедших от крупной белой и Мейшан [8]. Kaminski и Wojtasik [9] выявили положительную взаимосвязь между ESR/Ava I полиморфизмом и мясистостью .

Фрагменты , полученные нами при ПЦР - ПДРФ анализе полиморфизма ESR гена , соответствуют описанным Kamiñski и Wojtasik [9]. Наличие мутантной аллели ( М ), приводящей к образованию дополнительного сайта рестрикции рестриктазы AvaI, можно распознать по присутствию трёх фрагментов -76, 62, 47 пн , а в случае отсутствия мутации ( аллель W ) рестриктаза режет фрагмент на две части – 109 пн и 76 пн . Гетерозиготный носитель мутации ( MW ) характеризуется присутствием четырёх фрагментов : 109, 76, 62 и 47 пн .

При анализе полиморфизма гена ESR обнаружены 3 особи гомозиготные по W аллели , 2 особи гомозиготные по М аллели и гетерозигота ( генотип WM , 1 особь ) ( рис . 1).

Рисунок 1     –

Электрофореграмма

ПЦР-ПДРФ генотипирования ESR у свиней   (справа указаны размеры фрагментов, пн;

76 внизу : М – маркер молекулярного веса , 47 1 и 2 – генотипы WW , 3 – генотип ММ).

Полиморфизм гена белка , связывающего жирные кислоты (H-FABP), связан с содержанием внутримышечного жира у породы Дюрок [10]. При сравнении гомозиготных классов обнаружена разница около 15 % от среднего значения содержания внутримышечного жира [11]. Улучшение содержания внутримышечного жира связано не только с предпочтением покупателей мраморного мяса , но и с влиянием на органолептические свойства , такие как внешний вид , нежность и сочность [12].

Фрагменты , полученные в нашей лаборатории при ПЦР - ПДРФ анализе полиморфизма H-FABP гена , соответствуют описанным Li с соавторами [13]. Для А аллели характерно присутствие двух фрагментов : 683 и 117 пн . У аллели В присутствуют три фрагмента – 405, 278 и 117 пн . У гетерозиготных животных АВ присутствуют все 4 фрагмента (683, 405, 278 117 пн ., рис . 2). Данные А и В аллели видимо соответствуют D и d аллелям описанным у Gerbens c c оавторами (1999) [14].

При анализе полиморфизма гена H-FABP обнаружены гомозиготные по В аллели (3 особи ) и гетерозиготные ( генотип АВ , 3 особи ) генотипы ( рис .2). Аллель B (d) ассоциирована с повышенным содержанием внутримышечного жира [14].

RYR1 – ген рианодин рецепторного белка . Мутантная аллель данного гена (n) связана со стрессочувствительностью и влияет на некоторые параметры качества мяса и продуктивность . Появление такой мутации является одной из причин наследственного заболевания свиней стрессочувствительности . Ее крайнее проявление – злокачественный гипертермический синдром , а также плохое качество мяса . Все вместе эти признаки называются синдромом свиного стресса [15,16].

Исследования молодняка крупной белой породы показали , что лучшей энергией роста по откормочным качествам обладал срессоустойчивый молодняк , имеющий генотип NN по гену RYR1. Особи с таким генотипом на 22 дня раньше достигали живой массы 100 кг , среднесуточные приросты живой массы были выше на 77 г . В то же время , гетерозиготы ( Nn ), носители стрессочувствительного гена , отличались от сверстников с генотипом NN пониженной толщиной шпика , большей площадью « мышечного глазка » и большим содержанием мышечной ткани ( Черекаевой Е . А ., 2007).

Рисунок 2 –

Электрофореграмма ПЦР - ПДРФ генотипирования H-FABP у свиней ( мм – маркер молекулярного веса , АB – генотип образца , цифрами указаны размеры фрагментов , пн )

ММ

АB

Фрагменты, полученные при ПЦР-ПДРФ анализе полиморфизма RYR1 гена, соответствуют описанным Kamiñski и Wojtasik [9]. Мутация C11843T приводит к исчезновению сайта рестрикции рестриктазы Hin6I, поэтому присутствие мутантной аллели (n) можно распознать по фрагменту 272 пн, а в случае отсутствия мутации (аллель N) рестриктаза режет фрагмент на две части – 149пн и 123 пн. У гетерозиготного образца (Nn), носителя мутации на геле присутствуют три фрагмента: 272пн, 149 и 123пн.

При анализе полиморфизма гена RYR1 обнаружены гомозиготные по N аллели (4 особи ) и гетерозиготные Nn (1 особь ) генотипы ( рис . 3).

В результате оценки полиморфизма гена MC4R нами получены фрагменты , характеризующие полиморфизм гена , аналогичные описанным Li с соавторами [13]. Для А аллели характерно отсутствие сайта узнавания рестриктазы TaqI поэтому фрагмент , полученный при ПЦР остаётся неизменным (226 пн ). У аллели B сайт узнавания есть – рестриктаза режет ПЦР фрагмент на две части – 156 пн и 70 пн . Поэтому у гомозигот BB в геле два фрагмента – 156 и 70 пн , а гомозигот АА один фрагмент – 226 пн , ( см . рис . 4, образец № 6) и у гетерозиготных животных ( АB ) в геле обнаруживаются три фрагмента : 226, 156 и 70 пн , (c м . образец № 5).

Таблица 1 – ПЦР - ПДРФ генотипирование ESR, RYR-1, H-FABP, MC4R генов свиней

Ген	Праймеры `5-`3	Рестриктаза *	Литература
ESR эстроген рецептор	F:CCCTCTATGACCTGCTGCTG R:TCAGATTGTGGTGGGGAAGTTC	AvaI (Ama87 I)	[9, 17, 18]
RYR-1 рианодин рецептор	F:CTGGGACATCATCCTTCTGG R:GGGTTCTAAGCTCTGGGGTC	HspAI (Hin6I)	[9]
H-FABP белок , связывающий жирные кислоты	F:ATTGCTTCGGTGTGTTTGAG R:TCAGGAATGGGAGTTATTGG	HaeIII	[13,19]
MC4R- рецептор меланокортина 4	F:TACCCTGACCATCTTGATTG R:ATAGCAACAGATGATCTCTTTG	TaqI	[13, 20, 21]

*- рестриктазы фирмы Сибэнзим , Россия

Рисунок 3 – Электрофореграмма ПЦР - ПДРФ генотипирования RYR1 у свиней

( генотип образца № 3 – NN , генотип образца № 4 – Nn )

Данная методика впервые описана К im c соавторами (2000). Аллель А в данной работе именуется – аллель № 2, а аллель B – аллель № 1.

В гене рецептора меланокортина 4 (MC4R) обнаружена мутация , обусловливающая поглощение свиньями большего ( ≈ на 10%) количества корма , более быстрый рост (6-8%) и массу (6-10%) [20]. Контроль данной мутации при селекции может использоваться в селекции направленной как на снижение жира , так и на увеличение [8].

При анализе полиморфизма гена MC4R обнаружены 4 особи , гомозиготные по A аллели и 1 гетерозиготная особь ( генотип АB ).

Использование полиморфизма HFABP гена для маркер - вспомогательной селекции позволяет увеличить содержание внутримышечного жира без влияния на толщину сала [22, 12].

Kaminski и Wojtasik 2002 [9] обнаружили связь между ESR -AvaI полиморфизмом и мясистостью у крупной белой породы . Наибольшее значение данного параметра обнаружено у боровов с WM и ММ генотипами .

При генотипировании гена RYR 1 в условиях производства в промышленных хозяйствах , в отличие от племенных , целесообразно использовать животных не только с генотипом NN ( стрессоустойчивых ), но и с генотипом Nn ( стрессоустойчивые носители дефектного гена ), что будет способствовать получению качественных показателей мяса и его органолептического состава [23].

M56

Рисунок 4 – Электрофореграмма ПЦР - ПДРФ генотипирования MC4R у свиней

( м – маркер молекулярного веса , генотип образца 5 – АB , генотип образца 6 – АА ).

Аллель № 1 ( B ) гена MC4R ассоциирована с меньшим дневным привесом , употреблением корма и толщиной сала , чем аллель № 2 ( А ). При отборе животных полиморфизм MC4R гена можно использовать для селекции по вышеперечисленным признакам .

Использование ДНК диагностики интересующих аллелей в селекции и производстве свиней позволяет анализировать генотип особи на ранних этапах развития , ускорить селекционный процесс , улучшить качество получаемой продукции .