Использование G-излучения для получения тест-культуры Bacillus subtilis при определении B-литической активности крови

В обеспечении естественной резистентности организма млекопитающих важную роль играют бактериолизины лизоцим, β-лизины, а также система комплемента, которая в комплексе с антителами в значительной степени определяет бактерицидные свойства крови [1]. Защитное действие комплемента, лизоцима и антител изучено достаточно подробно, в то время как число публикаций, посвящённых β-литической активности крови, ограничено. Считают, что β-лизины представляют собой термостабильную субстанцию, особенно активную к аэробным спорообразующим бактериям, особенно Bacillus subtilis и Bacillus anthracis [2]. Активность β-лизинов определяется по степени лизиса тест-культуры Bacillus subtilis испытуемой сывороткой, выраженной в процентах. Известно, что сыворотка крови лошадей обладает максимальной β-литической активностью (до 80%), а минимальной – крупного рогатого скота и овец (до 35%) [3]. Высокие показатели β-литической активности характерны для осенне-зимнего, а более низкие – для весенне-летнего сезона года [4].

Повышение β-литической активности крови отмечается при острой пневмонии у детей и неспецифическом воспалении половых органов у женщин, понижение – при стафилококковой пневмонии, хроническом остеомиелите, черепно-мозговой и ожоговой травмах. Перед смертью β-литическая активность крови имеет минимальные значения, тогда как выздоровление сопровождается нормализацией этого показателя [2; 5-8]. Аналогичные результаты были получены при внешнем облучении сельскохозяйственных животных. Так, было установлено, что внешнее

Саруханов В.Я.* – ст. науч. сотр., к.б.н. ФГБНУ ВНИИРАЭ. Колганов И.М. – зав. лаб., к.т.н.; Царин П.Г. – ген. директор. ООО «НПП Эко-фильтр».

• *Контакты: 249032, Калужская обл., Обнинск, Киевское шоссе, 109-й км. Тел. 89056402821; e-mail: sarukhanov.vladimir@yandex.ru .

γ-облучение овец и лошадей в сублетальных дозах повышает β-литическую активность крови, тогда как гибель облучённых животных сопровождается угнетением этого показателя в латентный период [9-11].

Оценка физиологического состояния овец по двум показателям: β-литической активности и концентрации лейкоцитов в крови, повышает точность прогноза исхода острой лучевой болезни овец (до 5-х суток) [12].

Таким образом, β-литическая активность крови является одним из информативных показателей состояния организма животных и человека при физиологических и патологических и состояниях различной этиологии, поэтому её определение имеет важное клиническое значение в ветеринарии и медицине. Однако применение этого показателя, особенно при массовых исследованиях, бывает ограничено из-за трудоёмкости постановки реакции. Для постановки реакции используется суточная культура Bacillus subtilis , которую смывают со скошенного мясопептонного агара (МПА) 0,75 М раствором сахарозы с pH 6,2-6,4, с последующим доведением оптической плотности до 0,500 (зелёный светофильтр, длина волны 540 нм). Оптимальный размер частиц тест-культуры для определения β-литической активности крови составляет 100-400 мкм² [9]. Это достигается многократным пропусканием суспензии через пипетки с различным диаметром отверстия и последующей фильтрацией через неплотный ватно-марлевый фильтр, на котором остаются крупные микробные конгломераты. Подготовка к постановке реакции обычно занимает не менее 120 минут. Таким образом, продолжительность подготовки вместе с постановкой реакции для лошадей и жвачных животных составляет не менее 240 и 300 минут соответственно. Использование инактивированной тест-культуры позволит сократить время на подготовку к реакции и снизить её трудоёмкость.

Целью настоящей работы было изучение возможности использования γ-излучения для получения тест-культуры Bacillus subtilis , пригодной для определения β-литической активности крови сельскохозяйственных животных и человека.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили плазма крови животных: коров чёрно-пёстрой породы (n=30); беспородных лошадей (n=10) и сборная сыворотка крови клинически здоровых людей (n=20). Кровь у животных отбирали из яремной вены утром натощак. Плазму крови получали, центрифугируя цельную кровь при 3000 об/мин в течение 15-ти минут. Активность β-лизинов определяли по О.В. Бухарину с соавторами [2]. В реакции использовали суточную культуру эталонного штамма Bacillus subtilis (штамм 2216) , выращенную на плотной питательной среде (МПБ) . Для качественной оценки действия β-лизинов смесь сыворотки крови крупного рогатого скота с тест-культурой фотографировали через 60,120 и 180 мин; лошадей – через 60 и 120 мин после начала реакции под микроскопом «Биолам-2» с помощью микрофотонасадки «МФН-11», используя фотоаппарат «Nikon E 8400». На полученных фотографиях определяли размер микробных конгломератов с помощью программы Image expert pro. Культуру Bacillus subtilis облучали γ-лучами на установке «Исследователь» (источник излучения ⁶⁰Co, интенсивность 430 Гр/ч) в дозах от 10 до 70 кГр с шагом 10 кГр. Микробную суспензию перед облучением готовили на 0,75 М растворе сахарозы, с последующим удалением излишков раствора центрифугированием. Инактивацию тест-культуры Bacillus subtilis оценивали по отсутствию роста на жидкой и плотной питательных средах (МПБ, МПА) через 120 часов инкубации. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Excel.

Результаты и обсуждение

При облучении тест-культуры Bacillus subtilis в диапазоне доз от 10 до 60 кГр через 120 часов инкубации на плотной питательной среде (МПА) наблюдался рост колоний Bacillus subtilis и образование пленки на мясопептонном бульоне. Отсутствие роста культуры на мясопептонном бульоне и мясопептонном агаре (МПБ и МПА) имело место только при дозе 70 кГр. Стандартизация облучённой культуры 0,75 М раствором сахарозы перед постановкой реакции привело к образованию в рабочей суспензии частиц размером 100-300 мкм², без фильтрации, оптимальной для постановки реакции β-литической активности крови [9]. При использовании облучённой и нативной тест-культуры Bacillus subtilis β-литическая активность крови коров в параллельных пробах составила через 60 минут 9,2±0,8 и 6,0±0,6% (р≤0,05); через 120 минут 23,2±2,1 и 23,5±2,1% (р≥0,05); через 180 минут 32,5±3,2 и 35,6±4,2% (р≥0,05) соответственно. Следовательно, значения β-литической активности крови достоверно не отличались через 120 и 180 минут инкубации как при использовании нативной, так и облучённой суспензии тест-культуры (рис. 1). В реакции с плазмой крови лошадей значения β-литической активности крови составили 50,4±2,5 и 52,6±3,5% (р≥0,05) при использовании нативной и облучённой тест-культуры соответственно, а при исследовании сыворотки крови человека значения этого показателя достигали 36,8±3,5 с нативной и 41,2±3,5% (р≥0,05) с облучённой тест-культурой.

Рис. 1. β-литическая активность крови коров.

В плазме крови коров через 60 минут инкубации наблюдалось объединение частиц суспензии нативной и облучённой тест-культуры в агрегаты площадью 9000±900 и 7500±850 мкм2 с гомогенной структурой. Увеличение времени инкубации до 120 минут привело к уменьшению площади агрегатов до 6000±850 и 4000±350 мкм2 соответственно, с участками просветления по краям. Увеличение времени инкубации до 180-ти минут смеси плазмы крови и частиц нативной и облучённой тест-культуры привело к уменьшению площади агрегатов тест-культуры до 650±100 и 480±80 мкм2 соответственно (рис. 2). В обоих случаях наблюдалось увеличение участков просветления.

Время инкубации, мин

Рис. 2. Площадь микробных агрегатов в реакции.

Изучение сезонной динамики β-литической активности крови коров при использовании как нативной, так и облучённой тест-культуры Bacillus subtilis подтвердило общебиологическую закономерность, что максимальные значения β-литической активности наблюдаются в осеннезимний, а минимальные – в весенне-летний период времени [4, 5, 11]. Значения β-литической активности в параллельных пробах составили в апреле 30,3±2,5 и 35,3±1,5%; июле 29,8±1,9 и 30,2±2,5%; ноябре 33,7±3,4 и 35,6±3,4% и феврале 41,9±4,2 и 43,1±2,7% соответственно (табл. 1).

Таблица 1

β-литическая активность крови коров в разные сезоны года

Таким образом, реакция β-литической активности крови сельскохозяйственных животных и человека протекает однотипно как с нативной, так и с облучённой культурой Bacillus subtilis. Доза γ-излучения 70 кГр является летальной для культуры Bacillus subtilis (штамм 2216). Использование 0,75 М раствора сахарозы в качестве жидкой фазы микробной суспензии предотвращает распад колоний на отдельные клетки после γ-облучения, что, вероятно, связано, с тем, что микробная частица обволакивается сахарозой и существует в суспензии в виде отдельной частицы или мицеллы, что способствует её стабильности как во время облучения, так и при последующем разведении суспензии тест-культуры перед постановкой реакции. Это способствует получению частиц тест-культуры оптимального размера, без предварительной фильтрации, что упрощает постановку реакции и позволяет уменьшить расход реактивов.