Использование клеточных культур гепатоцитов для исследования метаболизма лекарственных соединений в печени человека

В результате развития технологий создания новых лекарственных соединений существующая методология доклинических испытаний лекарственных средств перестала удовлетворять возросшим требованиям фарминдустрии, так как крайне низкий процент разрабатываемых лекарственных веществ проходил клиническую стадию исследований и доходил до регистрации в качестве лекарственного средства. Одной из основных причин такой ситуации явилась низкая эффективность методов выявления по- бочных эффектов в доклиническую фазу испытаний [5]. Усилия, направленные на увеличение эффективности доклинической стадии, привели к изменению общего методологического подхода к определению побочного действия лекарственных веществ: для отбора наиболее оптимальных животных моделей для проведения фармакологических исследований были внедрены сравнительные исследования на культурах клеток человека и лабораторных животных, экстраполяцию действия исследуемого лекар- ственного вещества на человека стали проводить не только с данных, полученных при исследованиях на животных моделях, но и от исследований на культурах клеток человека [2, 7].

Печень является органом, где осуществляется центральный метаболизм большинства из существующих на сегодня лекарственных препаратов. В основном лекарственный метаболизм происходит в паренхиматозных клетках печени – гепатоцитах. На поверхности гепатоциты имеют рецепторы и белки транспортёры лекарственных веществ. В микросомах гепатоцитов содержатся главные ферменты лекарственного метаболизма, такие как цитохромы Р450, уридин глютатион трансферазы (UGT), некоторые глютатион-S-трансферазы (GST), флавин содержащие монооксигеназы (FMO). В цитозоле гепатоцитов растворены такие ферменты как сульфотрансферазы (SULT), N-ацетил трансферазы (NAT), некоторые GST, альдегид оксидазы (AO), ксантин оксидазы (XO). Митохондриальная мембрана гепатоцитов содержит моноаминоксидазы (MAO) [11]. Непаренхиматозные клетки печени, к которым относят синусоидальные клетки печени, бил-лиарные эпиталиальные клетки, клетки Купффера, стеллатовые клетки, а также макрофаги, нейтрофилы и натуральные киллеры крови приобретают большое значение при гепато-токсическом повреждении ткани печени, но при лекарственном метаболизме выполняют второстепенную, специфичную для каждого типа клеток задачу. Оптимальный режим жизнедеятельности клеток печени обеспечивает сложноорганизованная структура паренхимы печени. Структурный каркас паренхимы печени сплетён главным образом из волокон фибронектина, коллагена, фибриллин/эластина. Важно отметить, что вне структуры печени гепатоциты быстро теряют свои свойства, происходит процесс, так называемой дедифференциации, который запускается при разрушения межклеточных контактов гепатоцитов в ходе выделения из ткани печени. Исследования метаболизма лекарственных веществ (ЛВ) на клеточном уровне проводят на срезах печёночной ткани, культуре первично выделенных гепатоцитов, перевиваемых культурах клеток опухолевого и неопухолевого происхождения и гепатоцитах из плюрипотентных и стволовых клеток.

Гистологические срезы. Толщина срезов печеночной ткани 250–100 мкм лимитирована доступностью кислорода и питательных веществ, для клеток внутри среза. Такая толщина среза сохраняет 3-мерный матрикс печеночной паренхимы, но не сохраняет минимальную структурную единицу печени – лобулу, размер которой, как известно, 2 мм.

Размещённые в 3-мерном матриксе паренхимы гепатоциты печёночного среза длительно (более 72 часов) сохраняют активность ферментов и транспортных белков лекарственного метаболизма, но теряют различия в спектре метаболических и анаболических функций вдоль порто-центральной оси лобулы [9]. Печёночный срез не сохраняет своих первоначальных свойств после криоконсервации из-за разрушения межклеточных контактов гепатоцитов.

Первичную культуру гепатоцитов , также как и гистологические срезы, получают из материала операционных вмешательств на печени. Исследования динамики дедиференциации гепатоцитов, выделенных коллагеназным методом и культивируемых в монослое на коллагене в срок до 168 часов, показали, что до 24 часов паттерн экспрессии белков цитохрома Р450 сопоставим с аналогичным паттерном свежевыделенных гепатоцитов, паттерн белковой экспрессии ферментов II фазы метаболизма и лекарственных транспортёров сохраняется неизменным в течении 168 часов, а энергетическая и дыхательная функция гепатоцитов линейно снижается до нулевых отметок к 168 часам культивирования. Динамика дедифференциации гепатоцитов имеет значительное межиндивидуальное различие, которое определяется генетическими особенностями донора гепатоцитов и внешними факторами, воздействующими на физиологическую функцию печени (питание, болезни, приём лекарств, вредные привычки, профессиональные вредности, пол и т. д.) [8].

Дедифференциация и межиндивидуальные различия выделенных гепатоцитов человека ограничивают экстраполяцию данных исследований метаболизма ЛВ на клеточных моделях на аналогичные процессы, происходящие в печени человеческого организма, при воздействии исследуемого ЛВ. Межиндивидуальное различие является непреодолимым недостатком при использовании среза печёночной ткани в качестве клеточной модели метаболизма ЛВ, но преодолимо при работе на культуре свежевыделенных гепатоцитов человека путём сливания культур от разных доноров в один муль-тидонорный пул, условно представляющий целевую человеческую популяцию.

Дедиференциация существенно замедляется при размещении культуры клеток печени в каркасе, имитирующем структуру и состав печёночной паренхимы, а также добавлением в питательную среду ингибиторов дедифференциации. Считается, что мультидонорная культура свежевыделенных или криоконсерви-рованных гепатоцитов человека является наиболее точным аналогом печеночной ткани при исследованиях метаболизма ЛВ на клеточном уровне [3, 12–13].

Перевиваемые культуры гепатоцитов. Альтернативой культуре первичных гепатоцитов человека является перевиваемые линии гепатоцитов человека, которые обладают рядом преимуществ, таких как доступность и стандартность. По мнению большинства исследователей, наиболее подходящей моделью для исследования метаболизма ЛВ является линия гепатомы человека. Проводились сравнительные исследования метаболизма ЛВ в культуре свежевыделенных гепатоцитов человека, культуре гепатоцитов человека после криоконсервации и линии HepaRG после криоконсервации. Показано, что различия в уровне экспрессии мРНК изоформ цитохрома Р450 и UGT определяли различие временного профиля метаболитов тестовых лекарственных соединений между культурами свежевыделенных и размороженных гепатоцитов человека, с одной стороны, и культурой HepaRG с другой. Уровень экспрессии изоферментов цитохрома Р450 и UGT в суспензии свежих гепатоцитов резко снижается в течение суток, но сохраняется на приемлемом уровне в течение недели в 3-мерной культуре. В культуре HepaRG активность ферментов лекарственного метаболизма сохраняется в течение недели вне зависимости от способа культивирования [4].

Видоспецифичность биотрансформации ЛВ. Существующие качественные и количественные различия в ферментах лекарственного метаболизма у лабораторных животных и человека обуславливают несовпадение метаболических путей биотрансформации лекарственного вещества в печени, что является причиной видоспецифичной реакции организмов на то или иное ЛВ [7]. Полномасштабные исследования причин видоспецифичности биотрансформации ЛВ стали возможными после полного секвенирования генома человека и описания большинства белков протеома человеческой клетки. Исходя из накопленной информации о продуктах нескольких тысячей генов были проведены геном-масштабные реконструкции метаболической сети человеческой клетки, которые, в свою очередь, послужили отправной точкой для создания геном-масштабных реконструкций метаболической сети крысы и мыши. Таким образом, была реконструирована геном-масштабная модель метаболической сети крысы (Rattus norvegicus), включающая 2324 гена и 8268 реакции, и был проведён её сравнительный анализ с геном-масштабной моделью метаболической сети человека, включающей 2315 генов и 8263 реакции. В результате обширного сравнительного анализа большинство метаболических подсистем показали нулевое видоспецифическое различие. Однако и было показано, что видо-специфичность некоторых ферментов лекарственного метаболизма является причиной, которая не всегда позволяет использовать в качестве животной модели крысу [10].

Тем не менее при исследованиях метаболизма ЛВ используются первично выделенные гепатоциты крысы, в частности, чтобы сравнить соотношение «доза–эффект» (в отношении метаболических потоков лекарственного метаболизма) на уровне клетки, с соотношением «доза–эффект» на уровне организма. Изменение метаболических потоков лекарственного метаболизма определяют по изменению уровня экспрессии мРНК и белков или по концентрации лекарственных метаболитов в гепатоцитах, из клеточной культуры после экспозиции определённой дозы ЛВ, и гепатоцитах, выделенных из печени после введения крысе определённой дозы ЛВ. Разница в соотношении «доза– эффект» между гепатоцитом из культуры и гепатоцитом из печени показывает, в какой степени в биотрансформации ЛВ в организме крысы, помимо метаболизма ЛВ в гепатоцитах, задействованы другие факторы, такие как среда желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), способность всасывания из ЖКТ в кровь, взаимодействие с белками и клетками крови, характер распределения по органам и тканям, выделение почками и лёгкими и др.

Определение разницы в соотношениях «доза–эффект» для культуральных гепатоцитов человека и крысы, и гепатоцитов из ткани печени крысы делает возможным правильный подбор дозировок ЛВ для дальнейших более развёрнутых исследований на животных моделях. Данные, полученные при исследовании метаболизма ЛВ на клеточных культурах гепатоцитов, имеют определяющее значение при экстраполяции на организм человека, путём создания многоуровневых компьютерных моделей метаболизма лекарственных веществ на уровне организма человека [1].