The use of volatile fatty acids for rapid diagnosis anaerobic non-clostridial infections in purulent cholangitis patients with obstructive jaundice
Автор: Gagua A.K., Akaizin E.S., Valkov K.S.
Журнал: Московский хирургический журнал @mossj
Рубрика: Клинические исследования
Статья в выпуске: 2 (48), 2016 года.
Бесплатный доступ
Results of the treatment of 39 patients with obstructive jaundice and purulent cholangitis. For rapid diagnosis of infectious agents is further used in determining blood concentration by gas-liquid chromatography of volatile fatty acids which are metabolites opportunistic bacteria. Statistically significant thresholds of individual volatile fatty acids that allow to diagnose an anaerobic non-clostridial infection caused by the most severe forms of purulent cholangitis. The regularities of changes of indicators of volatile fatty acids, can further evaluate the response of host and microflora to the ongoing training and preoperative biliary decompression.
Idiopathic purulent cholangitis, volatile fatty acids, anaerobic non-clostridial infection
Короткий адрес: https://sciup.org/142211249
IDR: 142211249
Текст научной статьи The use of volatile fatty acids for rapid diagnosis anaerobic non-clostridial infections in purulent cholangitis patients with obstructive jaundice
Этиологическими агентами гнойно-воспалительных заболеваний являются условно-патогенные микроорганизмы, среди которых возрастает роль неклостридиальных анаэробных бактерий. Игнорирование этой инфекции приводит к ошибкам в этиологической диагностике, сохранению большой группы нерегистрируемых инфекций, проведению неадекватного лечения. Для решения практических задач требуется быстрое обнаружение возбудителей гнойной инфекции и их классификация как облигатных анаэробов или факультативных анаэробов. Эти данные необходимы для выбора антибактериальной терапии и решения вопроса о способе и объеме оперативного вмешательства.
Продолжается изучение основных причин бактериальной контаминации желчи при механической желтухе (МЖ)
[1, 2]. Считается, что основную роль при этом играет ахолия с нарушением нормальной рециркуляции пула желчных кислот. Поэтому активная колонизация тонкого кишечника микрофлорой сопровождается транслокацией бактерий и эндотоксинов в кровоток системы воротной вены [3]. Распространение получила также теория усиленной транслокации эндотоксинов и бактерий в портальный кровоток вследствие нарушений фагоцитарной функции клеток Купфера [4]. Эта теория обозначена термином «кишечнопеченочная ось» («gut-liver axis»).
Основанием для этапного лечения гнойного холангита (ГХ) при МЖ стали выработанные экспертами международные стандарты на согласительных конференциях 2007 и 2013 году в Японии [5, 6]. Поэтому тактикой лечения ГХ остается применение методик предоперационной билиар-

ной декомпрессии (БД). В то же время, БД не обеспечивает адекватную деконтаминацию желчных протоков, а нерациональная антибактериальная терапия на этом фоне приводит к селекции высокорезистентной микрофлоры [7]. Поэтому периоперационная антибактериальная терапия используется с учетом степени экскреции антибиотиков в желчь и чувствительности к ним микрофлоры. При бурной колонизации желчных протоков анаэробной микрофлорой возможно стремительное развития ГХ, несмотря на отсутствие выраженного холестаза и ахолии. В практической деятельности традиционная диагностика облигатных анаэробов чаще вызывающих наиболее тяжелые формы ГХ остается трудоемкой, а результаты бактериологического исследования получают не ранее чем через 5–6 дней после забора материала. Поэтому, до настоящего времени своевременная диагностика анаэробной микрофлоры у больных МЖ с ГХ представляет значительные трудности.
В качестве метода диагностики инфекции у больных с различной патологией все большее распространение получает газожидкостная хроматография (ГЖХ) [8,9,10,11]. С помощью ГЖХ определяется концентрация и спектр летучих жирных кислот (ЛЖК), являющихся метаболитами и маркерами патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Известно, что уксусную кислоту продуцируют факультативно-анаэробные и облигатно-анаэробные бактерии, а пропионовая, масляная и изовалериановая кислоты – метаболиты облигатно-анаэробной микрофлоры [10]. Метод основан на обнаружении в патологическом материале от больного летучих жирных кислот (ЛЖК), которые являются специфическими продуктами метаболизма облигатных анаэробов. Метод ГЖХ отличается от традиционного бактериологического исследования высокой точностью и чувствительностью, а главное - быстротой получения результата [10].
Цель исследования – оценка информативности показателей ЛЖК, в качестве экспресс-метода диагностики анаэробной инфекции у больных МЖ с ГХ.
Материал и методы
В исследование были включены 39 больных МЖ с ГХ, находившихся в хирургическом отделении для взрослых Ивановской областной клинической больницы, а также в хирургических отделениях 1-й и 4-й городских клинических больниц г. Иванова в период с 2010 по 2015 гг. Возраст пациентов составлял от 19 до 82 лет (в среднем 59,2 ± 3,0 года), среди которых было 28 (72 %) женщин и 11 (28 %) мужчин. Причинами МЖ были: множественный и мегахоледохоли-тиаз - 16, синдром Мириззи (СМ) – 5, ятрогенная стриктура внепеченочных желчных протоков – 4, хронический панкреатит (ХП) – 3, рак головки поджелудочной железы (ПЖ) – 3, рак большого сосочка двенадцатиперстной кишки (БСДПК) – 3, рак общего желчного протока (ОЖП) – 2, опухоль Клацкина (ОК) – 3. Диагноз основной патологии устанавливали на основании клинических и лабораторных данных, а также эндоскопических и лучевых методов исследования: УЗИ, МСКТ, МРТ. Для диагностики ГХ использовали клинические проявления и общепринятые признаки инфицирования: уровень лейкоцитов в крови, лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) по Я.Я. Кальф-Калифу, уровень С-реактивного белка, концентрация прокальцитонина, степень тяжести состояния по интегральным шкалам Glasgow и APACHE-II. Выполнялось бактериологическое изучение содержимого инфицированной желчи. Критериями при принятии решения о проведения БД была МЖ с ГХ.
Для изучения состава ЛЖК, после диагностики основного заболевания пациентам производили забор венозной крови в объеме 0,5 мл. Подготовка образцов включала добавление к указанному количеству крови 1 капли 10% серной кислоты, экстракцию диэтиловым эфиром. Газожидкостную хроматографию ЛЖК (уксусной, пропионовой, масляной и изовалериановой кислот) выполняли на автоматизированном газовом хроматографе «Кристаллюкс-4000» с капиллярной колонкой HP-FFAP (длина 50 м; диаметр 0,32 мм; толщина фазы 0,5 мкм) и пламенно-ионизационным детектором [12]. Идентификацию и количественное определение концентраций ЛЖК осуществляли при помощи аналитических стандартов и программного комплекса для обработки хроматографических данных «МультиХром».
Повторные исследования ЛЖК проводили на фоне предоперационной БД и интенсивного комплексного лечения.
Объективизация исследуемых показателей ЛЖК и эффективность проводимого лечения оценивалось на основании клинико-лабораторных данных, интегральных шкал, а также инструментальных методик обследования. Для статистического анализа использовали специализированный пакет программ Statistica версия 6.1 (StatSoft Inc.). Использовались следующие методы анализа: критерий Краскела-Уоллиса для множественного сравнения групп, U-критерий Манна-Уитни для сравнения двух независимых групп и критерий Вилкоксона для зависимых групп. Различия между группами считали значимыми при р < 0,05. Выборочные параметры, приводимые в таблицах: (M±m); М – средняя арифметическая вариационного ряда, m – ошибка средней арифметической.
Результаты и обсуждение
У всех 39 пациентов выявлялись повышенные значения ЛЖК, которые коррелировали с традиционными лабораторными и интегральными показателями (табл. 1).
Следует отметить, что у 7 человек с МЖ злокачественного генеза (рак головки ПЖ – 3, рак БСДПК – 2, рак ОЖП – 1, ОК – 1) и у 2 пациентов МЖ неопухолевого происхождения (ХП-1, множественный холедохолитиаз – 1) при явных ма-
Таблица 1
Средние значения уровня летучих жирных кислот, цитруллина и малонового диальдегида, а также лабораторных и интегральных показателей у больных МЖ с ГХ
Ведущую роль в инфицировании желчи при МЖ играет аэробно-анаэробная ассоциация микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта, поступающая, в том числе транслокацией. Уксусная кислота продуцируется факультативно-анаэробной и облигатно-анаэробной флорой, а пропионовая, масляная и изовалериановая кислоты в основном являются продуктами метаболизма только облигатно-анаэробных бактерий [10]. Нами изучена эффективность показателей ЛЖК в качестве экспресс-метода диагностики анаэробной неклостридиальной инфекции (АНИ) у этих больных.
По результатам исследования ЛЖК выделены две группы. Первую группу составили 31 пациент. У них показатели ЛЖК характеризовали наличие аэробной и факультативноанаэробной флоры. Во вторую группу включены 8 человек, у которых по результатам ЛЖК отмечалась АНИ в ассоциации и монокультуре. В связи с тем, что результаты бактериологического исследования, как правило, были получены не ранее чем через 5–6 дней после использования
Таблица 2
Средние значения уровня летучих жирных кислот цитруллина, и малонового диальдегда, а также лабораторных и интегральных показателей у больных в зависимости от клинических проявлений СВР
Показатели |
Значения у пациентов без проявлений СВР (n=9) |
Значения у пациентов с проявлениями СВР (n=30) |
ЛЖК, ммоль/л: уксусная пропионовая масляная изовалериановая |
0,457±0,021 0,0278±0,005 0,0045±0,0035 0,00034±0,00004 |
0,503±0,002 0,0291±0,0047 0,0068±0,006 0,00047±0,00054 |
Лейкоциты, 109/л |
23,4±3,71 |
25,3±2,49 |
ЛИИ, у. е. |
7,63±2,48 |
9,47±1,42 |
Малоновый диальдегид, нмоль/мл |
9,24±0,031 |
10,62±0,061 |
Цитруллин, ммоль/л |
11,4±0,063 |
13,25±0,4 |
С-реактивный белок, мг/л |
146±68 |
198±43 |
Прокальцитонин, нг/мл |
1,82±0,8 |
2,4±0,2 |
Тяжесть состояния по шкале APACHEII, баллы |
7,24±2,28 |
9,9±0,6 |
традиционных методик, анализ значений ЛЖК проводился ретроспективно. Установлено, что у больных первой группы на фоне повышенных средних цифр ЛЖК в большей степени повышалась концентрация уксусной кислоты, составившая в среднем 0,33±0,018 ммоль/л. Это объясняется тем, что уксусная кислота является общим метаболитом факультативно-анаэробной и облигатно-анаэробной флоры. У этих пациентов чаще высевались представители семейства энтеробактерий, в структуре которых в 76% случаев составили E.coli. У пациентов второй группы с выявленной АНИ установлено увеличение концентрации трех кислот: пропионовой > 0,012 ммоль/л, масляной > 0,0039 ммоль/л, изовалериановой > 0,00034 ммоль/л (табл. 3). Также в зависимости от вида микрофлоры выявлены достоверные различия по показателям прокальцитонина и степени тяжести состояния по шкале APACHE-II. При этом статистически значимых различий в подгруппах по уровню лейкоцитоза, ЛИИ и С-реактивного белка не установлено. Это можно объяснить выраженным токсическим действием метаболитов АНИ на звенья иммунитета.
Результаты, полученных позднее бактериологических исследований, показали, что преобладание повышения показателей одной из этих трех кислот были связаны с определенным возбудителем АНИ. Среди анаэробной флоры выявлены: Bacteroides spp. , Fusobacteria , Peptococcus (табл. 4). Следовательно, пропионовая, масляная и изовале-риановая кислоты будучи конечными продуктами метаболизма АНИ, являются ее специфическими маркерами при МЖ и ГХ. Раннее обнаружение и классификация микрофлоры способствовали выбору наиболее оптимального этиотропного антибактериального препарата в соответствии с современными рекомендациями.
С учетом выделенных групп определялась эффективность и продолжительность БД. Все 17 человек с множественным холедохолитиазом и мегахоледохолитиазом вошли в первую группу. У них в различные сроки после БД проводились оперативные вмешательства. При этом у 11 больных выполнялись минимально инвазивные вмешательства, а у 6 пациентов – открытые операции. У 7 пациентов первой группы на фоне БД и проводимого комплексного лечения, отмечено постепенное улучшение общего состоя- ния, сопровождаясь на 12 сутки снижением анализируемых показателей. Они были оперированы. У 6 больных выполнены следующие оперативные вмешательства: панкреатодуоденальная резекция (ПДР) – 4; бернский вариант операции Фрея -1; холецистэктомия (ХЭ), удаление конкремента, пластика дефекта ОЖП деэпителизированным фрагментом стенки желчного пузыря, холедохотомия (вне зоны свища), дренирование ОЖП по Керу – 1. У одного больного с ОК выполнено паллиативное вмешательство. Послеоперационный период протекал в основном без существенных осложнений. У остальных 7 пациентов первой группы улучшение состояния отмечено на 16 сутки, что также сопровождалось снижением значений ЛЖК. Им были выполнены следующие операции: ПДР – 3; ХЭ, удаление конкремента, пластика дефекта ОЖП деэпителизированным фрагментом стенки желчного пузыря, холедохотомия (вне зоны свища), дренирование ОЖП по Керу – 2; ХЭ, удаление конкремента, формирование холедохоеюноанастомоза по Ру – 1; бигепа-тикоеюноанастомоз по Ру – 1. При этом один больной погиб от гнойно-септических осложнений после ПДР, а второй -от инфаркта миокарда после операции по поводу СМ. Из 8 больных второй группы с установленной АНИ, несмотря на интенсивное лечение, состояние удалось стабилизировать в 5 случаях, в среднем через 3 недели. В послеоперационном периоде у всех больных отмечались различные осложнения и один из них погиб от гнойно-септических осложнений. У 3 больных, находящихся в исходно тяжелом состоянии, на фоне интенсивного лечения отмечалась отрицательная динамика, сопровождаясь постоянным ухудшением анализируемых показателей. Эти пациенты погибли от септического шока и полиорганной недостаточности. На вскрытии в печени также имелись множественные милиарные абсцессы.
Сравнительный анализ морфологических и бактериологических исследований с результатами определения ЛЖК и других анализируемых показателей показал их соответствие во всех наблюдениях.
Выводы
Проведенными исследованиями определены закономерности изменений показателей ЛЖК в зависимости от микрофлоры у больных МЖ с ГХ. С учетом установленных пороговых значений, ГЖХ можно использовать в качестве
Таблица 3
Лабораторные и интегральные показатели при ГХ в зависимости от микрофлоры
Микрофлора при ГХ |
Лейкоциты, 109/л |
ЛИИ, у. е. |
С-реактивный белок, мг/л |
Прокальцитонин, нг/мл |
Тяжесть состояния по шкале APACHEII, баллы |
Аэробная и факультативно-анаэробная флора |
23,6±1,56 |
7,9±1,68 |
168±8,27 |
2,3±0,78 |
7,6±0,32 |
АНИ |
27,4±4,3 |
10,8±2,14 |
212±23 |
3,1±0,15 |
11,4±0,87 |
Статистическая значимость различий |
p > 0,05 |
p > 0,05 |
p > 0,05 |
p < 0,01 |
p < 0,01 |
Таблица 4
Микрофлора |
Частота выявления (%) |
Escherichia coli |
12 (23 %) |
Enterobacter spp. |
8 (15 %) |
Klebsiella pneumonia |
7 (13 %) |
Staphylococcus aureus |
6 (11 %) |
Streptococcus spp. |
4 (8 %) |
Proteus vulgaris |
3 (6%) |
Ассоциации аэробов |
3 (6 %) |
Bacteroides spp. |
14 (27 %) |
Fusobacteria |
6 (11 %) |
Peptococcus |
3 (6 %) |
Другие анаэробы |
3 (6 %) |
Спектр микрофлоры при ГХ
экспресс-метода диагностики АНИ, вызывающей наиболее тяжелые формы ГХ. Динамическое определение ЛЖК является объективным критерием контроля эффективности и продолжительности предоперационной БД.