Использование метода масс-спектрометрии микробных маркеров в этиологической диагностике гнойно-воспалительных заболеваний кисти

Вопросы этиологической диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний кисти продолжают волновать практикующих хирургов, несмотря на многолетнюю историю изучения этой медикосоциальной проблемы. За последнее десятилетие частота встречаемости среди пациентов не имеет тенденции к снижению, а тяжесть течения самого гнойновоспалительного процесса нередко возрастает [1; 2]. Среди всех нагноительных процессов мягких тканей и костей гнойные заболевания кисти по-прежнему занимают первое место, составляя 15% случаев у пациентов впервые обратившихся за медицинской помощью [3; 4].

Одними из факторов определяющими эффективность лечебных мероприятий при гнойновоспалительных заболеваниях являются время и качество определения этиологического фактора. Существующие фенотипические методы идентификации, основанные на культивировании микроорганизмов на питательных средах, обладают недостатками (низкая скорость и относительно низкая информативность), не позволяющими вовремя сформировать мнение о видовом составе микрофлоры патологического очага, что в свою очередь затрудняет своевременную постановку клинического диагноза и назначение адекватной антибактериальной терапии.

Возникает необходимость поиска и внедрения новых диагностических технологий, которые могли бы

Крайнюков П.Е., Моисеев Д.Н., Жиленкова О.Г. и др.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ МИКРОБНЫХ МАРКЕРОВ В ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИСТИ обеспечить высокую скорость (не более нескольких часов), большую производительность, достаточную чувствительность и экономическую доступность клиникомикробиологического анализа. Важным требованием к методам диагностики является возможность получения достоверных результатов при работе с полимикробными биологическими образцами, содержащими смесь различных микроорганизмов [5].

В настоящее время тенденция персонифицированной медицины предполагает большее использование в рутинной практике лабораторной диагностики Омикс-технологий (геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика) наиболее перспективными из которых, в свете вышеизложенных задач, являются метаболомные методы исследования с использованием хромато-масс-спектрометрии.

ГХ-МС позволяет детектировать в исследуемых образцах биологического материала маркеры — компоненты микробной клетки и её метаболитов (жирные кислоты, альдегиды, спирты и стерины) — как эндогенной так и экзогенной микрофлоры, без предварительного выделения чистой культуры микроорганизмов, что особенно актуально принимая во внимание факт трудности культивирования анаэробов. Отличительные преимущества метода являются скорость анализа и возможность количественной оценки содержания маркера [6].

Цель работы выявить маркеры микроорганизмов методом ГХ-МС у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями кисти посредством параллельного измерения концентраций микробных маркеров в крови и содержимым гнойного очага (раневом отделяемом).

Материалы и методы

Произведено оперативное лечение 63 пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями кисти. Средний возраст пациентов — 40,2 года. Преимущественно отмечалось поражение правой кисти у лиц мужского пола, трудоспособного возраста. Среднее количество суток до обращения за медицинской помощью составило — 3,2. Антибактериальная терапия, до готовности результатов ан-тибиотикограммы, проводилась, исходя из эмпирического принципа ее назначения. Группой выбора препаратов для антибактериальной терапии была цефалоспорины III поколения, первый прием назначали в день госпитализации, после изъятия биологического материала для микробиологического исследования классическими культуральными методами и химического анализа методом ГХ-МС.

Перед операцией все пациенты комплексно обследованы клинически, инструментально и с использованием лабораторных методов диагностики. Хирургическое лечение выполняли под проводниковой анестезией, на уровне локтевого сустава. Объем оперативного лечения включал: вскрытие, санацию и дренирование гнойного очага, с использованием отжимного жгута на уровне предплечья. Во время операции производился забор содержимого гнойного очага стерильным хлопчатобумажным тампоном на пластиковой палочке от пробир-

Рис. 1. Забор содержимого гнойного очага стерильным хлопчатобумажным тампоном.

Рис. 2. Газовый хроматограф с масс-спектометром.

ки для микробиологических исследований без наполнителя (Рис. 1). Изымалась капиллярная кровь в пробирки с ЭТДА объемом 2 мл. Повторный забор биологического материала проводили на 3 сутки после операции.

Так же проводилось классическое микробиологическое исследование, путем посевов на твердые питательные среды (желточно-солевой агар, кровяной агар, среда Эндо, среда Сабуро). Определение антибиотико-чувствитель-ности проводили по стандартной методике [7].

С целью обнаружения маркеров потенциальных возбудителей, в данных биологических образцах, было проведено исследование вышеуказанного материала посредством физико-химического анализа методом ГХ-МС с последующим алгоритмом автоматическим расчета, предложенным Г.А. Осиповым [8] (Рис. 2).

Принадлежность маркеров к конкретным микроорганизмам определялась посредством базы данных Национального института стандартов и технологий (NIST, USA), и входящим в алгоритм программ прибора Шерлок (MINI Inc, Delaware, USA) для хроматографической идентификации микроорганизмов по жирно-кислотным компонентам.

Результаты исследования

В раневом отделяемом и крови пациентов при анализе методом ГХ-МС обнаружены жирные кислоты, гидроксикислоты, циклопропановые кислоты, стерины являющиеся компонентами фосфолипидного бислоя бактериальной клеточной стенки и мембран, а также результатом метаболизма микрофлоры и макроорганизма.

В исследуемых образцах биологического материала, выявили более чем двукратное превышение концентраций следующих веществ: 7 гексадеценовая кислота (компонент клеточной стенки), 10-оксисте-ариновая и 10-оксидеценавая кислоты (продукты ферментативного гидролиза тканей макроорганизма ферментами микробов), изодеканавая и изодеценовые кислоты. По этим кислотам детектируют представителей клостридий ( Clostridium propionicom, Сl.ramosum, Cl.difficile, Cl.Hystolyticum, Cl.perfringens ). Цис-вактеновая кислота ( Lactobacillus spp. ), Октадеценовый альдегид ( Bifidobacterium spp. ), транс-9, 10-гексдеценовая кислота ( Nocardia asteroides ), 3-гидрокси-изопентадекановая кислота ( Prevotella spp. ), антеизо-нонадекановая кислота ( Staphylococcus spp. ), изогептадеценовая кислота ( Campylobacter mucosalis ), изо-пентадекановый альдегид ( Propionibacterium freudenreichii ), циклогептадекановая кислота (семейство Enterobacteriaceae , при отсутствии псевдоманад), дегидрохолестерол ( Eubacterium ), изо-гексадекановый альдегид ( Eggerthella lenta ), антеизотри-декановая кислота ( Bacillus cereus ) (Рис. 3).

В крови определялись эти же соединения, но в значительно меньшей концентрации (выше пределов детекции).

При классическом бактериологическом исследовании, содержимого гнойного очага, полученного при первичной операции из 63 (100%) посевов, в 4 (6,35%) рост микробной флоры не был обнаружен, в 40 (63,5%) определился Staphylococcus aureus , в 9 (14,3%) — Streptococcus pyogenus , в 5 (7,8%) — Staphylococcus еpidermidis , в 2 (3,17%) — Escherichia coli , в 2 (3,17%) — Staphylococcus «Koa-» , 1 (1,58%) — Enterococcus faecalis (Рис. 4, 5). При анализе результатов классического бактериологического исследования отмечено, что микроорганизмы преимущественно определяются в виде монокультуры. В нашем исследовании было зафиксировано 38 (66,6%) случая микст инфекции который состоит из следующих микроорганизмов: 1) St.aureus +Srt. Pyogenes ; 2) St.aureus

Рис. 4. Колонии St. aureus.

кл/гх 10*5

Ns Микроорганизм		Проба	Норма
1	Staphylococcus spp.	710	45
2	Eggerthella lenta	285	40
3	bacillus cereus	348	41
4	Nocardia spp.	1125	94
5	Clostridium propionicom	217	94
6	Clostridium ramosum	2925	992
7	Staphylococcus epidermidis	78	0
8	Lactobacillus spp.	3455	659
9	Campylobacter mucosalis	38	0
10	Clostridium spp. (группа C. tetani) 597		245
11	Clostridium difficile	151	0
12	Prevotella spp.	35	10
13	Eubacterium spp.	4497	565
14 Staphylococcus aureus		720	30
15	Bifidobacterium spp.	1422	225
16 Clostridium perfringens		950	84
17	Enterococcus spp.	105	0
18 Propionibacterium freudenreichii		2088	243
19	Nocardia asteroides	267	40
20	Blautia coccoides	192	0
	Сумма	20206	3406

0 500 1500 2500 3500 4500

• 1    —

• 2    -

• 3    ~

• 4    —

• 5    ‘

• 6    ЕЕ

• 8    =

ю Е-

11 :

13=7~

15 ~

16 :—

18 Е

20 ~

Проба

Рис. 5. Колонии St. еpidermidis.

Рис. 3. Графический пример результата исследования раневого отделяемого физико-химического анализа методом ГХ-МС.

Крайнюков П.Е., Моисеев Д.Н., Жиленкова О.Г. и др.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ МИКРОБНЫХ МАРКЕРОВ В ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИСТИ

В полученных результатах методом ГХ-МС также выявлено присутствие четырех предполагаемых возбудителей ( St.aureus, St. еpidermidis, Escherichia coli, Str. spp. ) в очаге воспаления, которых нам удалось получить культуральными методами, что подтверждает его состоятельность как экспресс метода диагностики. Данные о составе микробиоты позволяют утверждать о лидирующей роли аутофлоры, преимущественно анаэробной природы, в поддержании очага гнойного воспаления, появившейся в нем посредством транслокации кишечной микрофлоры. Анаэробные бактерии являются значимыми составляющими нормального микробиома человека, большая часть заселяет биотоп толстой кишки 10 ¹⁰ -10 ¹² КОЕ/гр.

Большинство определяемых видов микроорганизмов либо трудно культивируемые, либо некультивируе-мые. R.Berg определил бактериальную транслокацию как прохождение жизнеспособных бактерий и их токсинов из желудочно-кишечного тракта через слизистую оболочку в экстраинтестинальные участки макроорганизма (мезентериальные лимфоузлы, печень, селезенку, кровоток) [9].

Роль этого феномена в патогенезе хирургической инфекции подробно описана в трудах Н.И. Никитенко [10]. Компоненты клеточных мембран микроорганизмов в крови появляются в результате фагоцитоза, ферментативного лизиса белковым комплементом крови или автолиза. Наличие микробных маркеров в крови отражает состав микробных консорциумов тела человека, независимо от места обитания микроорганизмов или очага воспаления [11]. Определение в крови маркеров микроорганизмов не дает оснований для предположений о наличии генерализованного септического процесса, хотя и детектируются в соизмеримых концентрациях с ведущим этиологическим объектом.

Выводы

• 1.    Таким образом метод ГЗ-МС позволяет определить наличие бактериальной транслокации кишечных микроорганизмов в очаг гнойного воспаления.

• 2.    Выявление маркеров микроорганизмов одновременно в крови и очаге гнойного воспаления позволяет определить их как потенциально этиологические агенты.

• 3.    Преобладание анаэробной микрофлоры в очаге воспаления подчеркивает необходимость применения антибактериальных препаратов, активных в отношении анаэробной флоры.

• 4.    Скорость проведения исследования материала методом ГХ-МС является неоспоримым преимуществом (не более 4 часов) этого метода, позволяющего использовать его в качестве экспресс метода изучения состава микробиоты биотопов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).