Использование микробно-растительных ассоциаций для очистки почвы от нефтяного загрязнения

Фиторемедиация за последние десятилетия стала очень активно развивающимся и перспективным биотехнологическим направлением очистки окружающей среды. В большом количестве работ показана эффективность использования растений для биоремедиации почв, загрязненных самыми разнообразными поллютантами, в том числе нефтью и ее компонентами [1, 2]. Однако более широкое применение фиторемедиации ограничивает слабая изученность механизмов очистки с использованием микробно-растительного взаимодействия. Основным механизмом фиторемедиации почв от данных загрязнителей является их деструкция микроорганизмами, ассоциированными с растениями [1, 3]. Кроме того, в литературе распространено предположение, которое слабо подтверждено экспериментально, о влиянии растений на очистку почвы от нефти через выделение ими поверхностноактивных веществ (ПАВ) [3]. Также существенным недостатком использования растений для рекультивации нефтезагрязненных почв является их высокая чувствительность к нефтяному загрязнению, вследствие чего фиторемедиация используется на почвах с низким нефтяным загрязнением. Поэтому необходима разработка методов повышающих выживаемость и продуктивность растений для использования фиторемедиации на почвах с высоким содержанием нефти. Наибольшее негативное действие нефтяное загрязнение оказывает на проростки растений [4], при этом посев семенами это основной способ посадки травянистых растений при фиторекультивации, использование взрослых растений при фиторемедиации нефтезагрязненных почв является малоизученным. Целью настоящей работы является оценка влияния растений на численность бактерий-деструкторов нефти в почве и эмульгирующую активность почвенного раствора, а также эффективности применения взрослых растений для очистки нефтезагрязненной почвы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

С целью изучения роли микробно-растительных систем в очистке почвы от нефтяного загрязнения в полевых условиях были высажены семенами и однолетней рассадой растения 4 видов: клевер луговой ( Trifolium pratense L.), клевер ползучий ( T. repens L.),

кострец безостый ( Bromopsis inermis (Leys.) Holub.), овсяница луговая ( Festuca pratensis Huds). Почва с корней и корневищ растений, выращенных рассадой, перед посадкой была смыта водой для того, чтобы избавится от эффекта разбавления нефтязагрязненной. почвы.

Эксперимент проводился на экспериментально нефтезагрязненных площадках через 3 года после загрязнения, находящихся на опытном стационаре в д. Ключи Добрянского района Пермской области. Для загрязнения использовали нефть Ярино-Каменноложского месторождения (содержание парафинов – 5,4%, серы – 0,51-0,79%, плотность – 0,8160,838 г/см3). Доза нефти 24 л/м2. Почва участка биостанции дерново-подзолистая среднесуглинистая, гумус – 2,86 %, рН водный – 6,3, рН солевой – 5,6, N общий – 0,123%.

Эмульгирующую активность почвенного раствора почвы без растений оценивали следующим методом, 20 г почвы помещали в колбу заливали 50 мл дистиллированной воды, выдерживали 1 час и встряхивали на ротаторе 10 мин со скоростью 180 оборотов в мин. Суспензию центрифугировали 20 мин при 8000 g, эмульгирующую активность (E 24 ) надосадочной жидкости измеряли по методу [5]. Для измерения эмульгирующей активности почвенного раствора ризосферы надземную часть растений обрезали, оставляя 5 см до корней, и взвешивали. Корни с почвой помещали в химический стакан и заливали дистиллированной водой в количестве равном массе растения с почвой, выдерживали 1 час. Осторожно удаляли почву с корней кисточкой, растения слегка подсушивали между листами фильтровальной бумаги и взвешивали. По разнице массы растений с почвой и растений с отмытыми корнями вычисляли массу ризосферной почвы. В химический стакан добавляли дистиллированную воду до установления соотношения почва, г: вода, мл - 2 : 5 и переносили в колбу. Дальнейшую подготовку суспензии и определение эмульгирующей активности проводили аналогично, как было описано выше. Учет численности нефтеокисляющих микроорганизмов в ризосфере, а также эмульгирурующую активность почвенного раствора проводили через 30 сут после начала эксперимента. Численность микроорганизмов оценивали по общепринятой методике [6] высевом почвенной суспензии на агаризованную Раймонда (г/л): NH 4 NO 3 – 2,0; MgSO 4 х 7H 2 O – 0,2; K 2 HPO 4 –

Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2013. Т. 15, № 3 (5)

2,0; Na 2 HPO 4 – 3,0; CaCl 2 х 6H 2 O – 0,01; Na 2 CO 3 – 0,1 с добавлением нефтяной эмульсии до концентрации нефти в среде 0,1%. Эмульсию готовили с помощью диспергирования ультразвуковым дезинтегратором UD-20 при максимальной амплитуде в течение 5 минут смеси 10% нефти в дистиллированной воде с добавлением 0,05% твина-80. По образованию зон просветления вокруг колоний микроорганизмов судили о наличии у них нефтеоокислющей активности.

Содержание нефти в почве и массу выращенных растений измеряли через 4 месяца после начала эксперимента. Анализ содержания нефти в почве проводили гравиметрическим методом после экстракции хлороформом. Для оценки влияния нефтяного загрязнения на растения измеряли сухой вес растений и рассчитывали процентное отношение общей биомассы растений на нефтезагрязненных площадках к общей биомассе растений на участках без загрязнения.

Достоверность полученных результатов определяли с помощью критерия Стьюдента, статистическую обработку проводили в программе Microsoft Excel 2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Предположение о влиянии растений на очистку почвы от нефтяного загрязнения через выделение ими ПАВ, выдвинутое в ряде работ, основывается на данных о наличии эмульгирующей активности у корневых экссудатов растений и муцигеля, слизистого слоя на поверхности корней [7, 8]. Кроме того, способность к продукции ПАВ довольно часто встречается у ризосферных микроорганизмов [9, 10]. В одном из немногих исследований подтверждающем существование эффекта выделения ПАВ микробнорастительными системами достаточном для воздействия на биоремедиационнные процессы установлено, что в сосудах с нефтезагрязненной водой в присутствии водных растений, в отличие от сосудов без растений, происходила частичная эмульгация нефти [11].

В проведенном эксперименте выявлена зависимость величины эмульгирующей активности почвенного раствора почвы без растений от нефтяного загрязнения. Если в почве без загрязнения она составляла 0%, то в нефтезагрязненной почве – 2,9%. Как известно, углеводородокисляющая активность микроорганизмов не редко связана с выделением ими ПАВ [12], поэтому измерение эмульгирующей активности почвенного раствора может быть использовано для мониторинговых исследований почв загрязненных нефтью и нефтепродуктами, а также для косвенной оценки углеводородокисляющей активности почвенных микроорганизмов. Эмульгирующая активность водных вытяжек из ризосферы значительно превышала таковую из почвы без растений, от 7,8 до 10,2 раз в вариантах эксперимента с высадкой взрослых растений и от 8,2 до 8,8 раз в случае посадки растений семенами (рис. 1), что указывает на продукцию ПАВ микробно-растительными системами. ПАВ повышают эмульгирующую активность почвенного раствора, что приводит к диспергированию нефти в эмульсию, увеличивает площадь контакта нефти с клетками микроорганизмов, улучшает аэрацию и снижает гидрофобность почвы и, таким образом, способствуют микроб-

□ посадка рассадой □ посев семенами

Рис. 1. Эмульгирующая активность почвенного раствора почвы без растений и ризосферы

Корневые выделения, поступая в почву, оказывают воздействие на численность и таксономическое разнообразие микроорганизмов в прикорневой зоне растений [13]. Показано, что численность микроорганизмов, способных деградации нефти, в ризосфере всех изученных растений была выше, чем в почве без растений (рис. 2), поэтому растения потенциально могут повышать деструкцию нефти в почве. Наименьшее отличие в численности данных микроорганизмов между ризосферой и почвой без растений в 12,7 раза отмечено в ризосфере растений овсяницы, выросших из семян, наибольшее – 58,6 раза в ризосфере клевера также в варианте с посадкой семенами.

Эмульгирующая активность и численность микроорганизмов, способных к деструкции углеводородов, были высокими как в ризосфере растений, выращенных из семян, так и посаженных рассадой. Но на деструкцию нефти наиболее сильное влияние растения оказали только при последнем способе посадки (рис. 3), что было связано с крайне низкой общей фитомассой растений в вариантах с посадкой растений семенами (рис. 4), которая составляла в данном случае у клевера - 1,8 г/м2, костреца - 31,8 г/м2, овсяницы - 37,8 г/м2. Максимальная убыль нефти в почве - 43,4% отмечена в эксперименте при посадке взрослых растений клевера, минимальная – 5,6% наблюдалась в случае с высадкой клевера семенами, в котором общая биомасса растений была самой низкой среди всех вариантов опыта.

растении клевера костреца овсяницы

□ посадка рассадой □ посев семенами

Рис. 2. Численность нефтеокисляющих микроорганизмов в почве без растений и в ризосфере

□ посадка рассадой □ посев семенами

Рис. 3. Влияние посадки растений на деструкцию нефти в почве

клевер кострец овсяница

□ посадка рассадой □ посев семенами

Рис. 4. Процентное отношение биомассы растений на нефтезагрязненной почве к биомассе растений на чистой почве

Таким образом, изученные растений повышают численность микроорганизмов-деструкторов нефти, также микробно-растительные системы способны к продукции ПАВ, вследствие чего посадка растений в нефтезагрязненную почву положительно влияет на ее способность к самоочищению. Однако, основным препятствием для использования микробнорастительных систем при биоремедиации нефтезагрязненных почв является сильное негативное действие нефти на растения. Поэтому необходима разработка методов и приемов, использование которых понижает данное воздействие нефтяного загрязнения.

Один из таких способов это посадка взрослых растений, которые менее чувствительны к нефтезагязне-нию, чем растения, посеянные семенами.