Использование микробных полисахаридов для обработки семян

Одна из актуальных проблем сельского хозяйства состоит в увеличении урожайности, сохранении плодородия почв, ростостимуляции, улучшении питания растений, увеличении влагоудерживающей способности семян. Регуляторы роста оказывают существенное влияние на все аспекты развития растений. Многофункциональность их воздействия привела к значительному расширению области их применения в растениеводстве, изучению действия полисахаридов как добавки к основным препаратам.

В современной биотехнологии растениеводства широко используются биопрепараты на основе ризосферных микроорганизмов, соответствующие требованиям экологической безопасности и обладающие широким спектром положительного действия на растения. Эффективные микробные препараты способны сохранять высокий титр и физиологическую активность клеток в течение длительного времени [6].

В настоящее время все большее внимание исследователей привлекает введение в состав биопрепаратов наполнителей, стабилизаторов, биологически активных веществ, гелеобразующих компонентов, способствующих не только продлению сроков хранения, но и повышению адгезивных свойств биоагентов и их выживанию после инокуляции. Такие добавки должны быть безвредными для природных экосистем и человека. Улучшение свойств биопрепаратов может достигаться как за счет увеличения продукции экзополисахаридов (ЭПС) самими продуцентами, так и за счет введения в них полисахаридов других микроорганизмов.

В практике растениеводства широко используются липкогенные экологически безопасные препараты, такие как экзополисахаридакриламид (ЭПАА), «Райкат Старт» и др. Они используются в технологиях выращивания сельскохозяйственных растений в качестве прилипателей. На основе бактериального экзополисахарида ксантана и ЭПАА разработана липкогенная композиция, введение которой в инокулянты обеспечивает выживаемость ризобий при хранении [11].

Показано, что биопрепараты, содержащие в своем составе полисахариды, увеличивают полевую всхожесть и стимулируют рост растений; выполняют роль быстро доступных запасов энергии; продлевают срок действия микробных препаратов и пестицидов. Растения, обработанные такими препаратами, быстро поглощают воду и питательные элементы, тем самым инициируя более раннюю фотосинтетическую активность и укорачивая цикл созревания урожая [10; 11]. При этом гельные препараты имеют ряд преимуществ и, по данным многих авторов, часто оказываются более эффективными, чем жидкие [4; 9]. Так, покрытие семян воздухо- и водорегулирующей пленкой, способствует повышению устойчивости растений к стрессам и фитопатогенам в ранних фазах онтогенеза, а также защищает интродуцируемые и аборигенные почвенные микроорганизмы от повреждающего действия экстремальных факторов (температуры, высушивания, УФ-радиации) [8].

Цель работы : исследование влияния микробных полисахаридов на влагопоглотительную способность и развитие семян пшеницы.

Материалы и методы. Объектом исследований явились культуральные жидкости Xanthomonas campestris B-2373 D и Azotobacter vinelandii Д-08, содержащие ЭПС ксантан и леван соответственно. В качестве материала для исследования использовали семена озимой пшеницы сорта «Московская 39».

Для получения биопрепарата на основе бактерии Azotobacter vinelandii использовали мелассную среду с добавлением минеральных солей. Культивирование проводили в термостатируемом шейкере при 150 об/мин и 28 °С в течение 48 часов. Полученный препарат, содержащий живые клетки (10⁹- 10¹⁰ КОЕ/мл) и микробные метаболиты, хранили при 4 °С в течение 40 сут.

Бактерию Xanthomonas campestris выращивали на мелассной среде в термостатируемом шейкере при 150 об/мин и 28 °С в течение 4 сут. Затем культуральную жидкость (КЖ), содержащую ксантан, подвергали термолизу (80 °С, 1 ч) для инактивации бактерий.

Полученные препараты использовали для обработки семян пшеницы при разведении водой 1:100.

Для определения влагопоглотительной способности выровненные семена пшеницы в количестве 50 штук обрабатывали в течение 1 часа следующими вариантами: контроль – водопроводная вода, опыт 1 – КЖ Xanthomonas campestris , опыт 2 – КЖ Azotobacter vinelandii.

После выдержки семена помещали в кювету с фильтровальной бумагой и подсушивали в течение 20 ч. По истечении данного времени семена взвешивали, помещали во влажную камеру и каждый час проводили расчет связанной воды.

В процессе хранения КЖ Azotobacter vinelandii количество синтезируемого полисахарида левана определяли гравиметрическим методом. Для этого 10 мл КЖ Azotobacter vinelandii центрифугировали при 8000 g в течение 15 мин для осаждения клеток. Затем отбирали 5 мл супернатанта, приливали 5 мл 96% этилового спирта, выдерживали при комнатной температуре в течение суток, отделяли осадок и высушивали при 50 °С до постоянной массы в течение 24 ч. Высушенную массу взвешивали на аналитических весах с точностью до 0,0001 г.

Для анализа влияния ЭПС на развитие семян определяли энергию прорастания – количество семян, проросших при заданных условиях за трое суток. Для этого опытные и контрольные семена пшеницы в количестве 100 штук помещали в чашки Петри на смоченную водой фильтровальную бумагу. Проращивание вели в климатической камере при 20 °С. Через 3 дня подсчитывали количество проросших семян и выражали в процентах от исходного числа.

Экспериментальные результаты обрабатывали статистическим методом дисперсионного анализа с использованием пакетов специальных программ Microsoft Excel 2010.

Результаты и их обсуждение. Для улучшения роста и минерального питания растений часто используют биопрепараты на основе ризосферных бактерий. На кафедре биотехнологии, биоинженерии и биохимии в этом направлении активно ведутся работы с высокопродуктивными штаммами Pseudomonas aureofaciens В-11364 и Azotobacter vinelandii Д-08. Показана возможность использования мелассы в качестве основного компонента среды для культивирования данных бактерий, что повышает адгезивные свойства и снижает себестоимость готовых биопрепаратов. Кроме того, за счет способности Azotobacter vinelandii синтезировать ЭПС леван отпадает необходимость дополнительного использования прилипателей при обработке семян культуральной жидкостью бактерий [1; 7]. Также в качестве связующего можно использовать культуральную жидкость, содержащую ксантан, полученную при культивировании Xanthomonas campestris на мелассе [5].

В результате проведенных исследований было показано положительное действие микробных ЭПС левана и ксантана на энергию прорастания и влагопоглотительную способность (ВПС) биообработанных семян пшеницы.

Во всех вариантах максимальное влагопоглощение семян отмечено в течение первых 60 мин. В дальнейшем количество поглощаемой влаги снижалось, и через 4 часа было минимально. Наибольшие значения ВПС выявлены при обработке семян ксантаном. Так, за весь исследуемый период количество поглощенной воды составило 0,0139 г, что на 7,2 % и 29,5 % больше, чем в варианте с леваном и в контроле соответственно (см. рис. 1).

Рис. 1. Динамика ВПС семян пшеницы при обработке ЭПС.

Высокое водопоглощение ксантана обусловлено его способностью формировать гель. Уже при концентрации полисахарида 0,1% вязкость системы возрастает на порядок. При обработке семян раствором ксантана на поверхности создается полисахаридная оболочка, позволяющая поглощать большее количество воды по сравнению с леваном.

В связи с тем, что при проведении опыта использовалась КЖ, содержащая живые клетки Azotobacter vinelandii , то во время ее хранения количество левана, синтезируемого бактериями, изменялось. Так через 10, 20 и 30 суток хранения КЖ при 4 °С количество левана составило 3,4, 3,8, 4,0 г/л соответственно. При этом с увеличением количества левана ВПС семян также повышалась (в 1,7 и 2,2 раза через 20 и 30 сут относительно 10 сут хранения КЖ соответственно).

В дальнейшем содержание левана в КЖ снизилось, что может быть обусловлено его гидролизом. Из литературы известно, что микроорганизмы способны использовать внеклеточные полисахариды в качестве энергетических субстратов и источника электронов в реакциях дегидрирования, являющихся обязательным этапом окислительновосстановительных процессов в микробной клетке, а также в качестве источников углеродного питания, включая ЭПС или продукты их деструкции в конструктивный обмен [2].

Обработка семян биопрепаратами способствует высокой энергии прорастания семян и развитию растений, что обусловлено положительным влиянием бактериальных метаболитов [3]. Присутствие ЭПС также положительно воздействует на развитие растений.

Нами было показано, что при обработке семян в опытных вариантах с леваном и ксантаном значения энергии прорастания составили 88% и 95%, что на 7,4% и 20% больше, чем в контроле соответственно. При использовании КЖ Azotobacter vinelandii , хранившейся в течение 20 сут, показатель энергии прорастания достиг 100%, что свидетельствует о стимулирующем воздействии, как бактериальных метаболитов, так и полисахарида

(см. рис. 2).

Рис. 2. Влияние ЭПС на прорастание семян пшеницы.

Таким образом, исследуемые микробные экзополисахариды оказывают благоприятное влияние как на семяна пшеницы, так и на бактерии в культуральной жидкости, создавая оптимальные условия для их развития. Тем самым ксантан и леван могут выступать как биологически активные вещества для повышения качества микробных препаратов с пролонгированным сроком хранения.