Использование молекулярных маркеров R генов и типов цитоплазмы при интрогрессивной гибридизации диких полиплоидных мексиканских видов картофеля

Благодаря изучению диких и культурных видов картофеля из коллекции ВИР (Всероссийский институт генетических ресурсов растений), формирование которой началось на основе экспедиционных сборов 1926-1933 годов (1), отечественные ученые создали теорию о центрах его происхождения и разнообразия (1, 2), впервые обосновав и начав реализовывать новое на тот момент направление в мировой селекции картофеля — интрогрессивную межвидовую гибридизацию (1-4). К концу ХХ века межвидовая гибридизация стала основным методом селекции этой культуры благодаря разра-

^∗ Исследования по оценке устойчивости к фитофторозу в эпифитотийный сезон 2016 года, молекулярному скринингу и определению фертильности пыльцы (2016-2017 годы, ВИР, г. Санкт-Петербург, Россия) поддержаны грантом РНФ ¹ 16-16-04125. Гибридизация, оценка устойчивости к фитофторозу и Y-вирусу картофеля (2012-2015 годы, Swedish University of Agricultural Sciences — SLU, Швеция) выполнены при поддержке фонда E. & I. Nilssons Foundation.

ботке способов преодоления пре- и постзиготической межвидовой несовместимости, включающих планирование скрещиваний на основе значений эффективной плоидности (EBN — endosperm balance number) родительских видов, изменение плоидности скрещиваемых образцов, поиск видов-посредников, использование реципрокных скрещиваний для нивелирования ядерно-цитоплазматических конфликтов, что позволило привлечь в селекционный процесс дикие виды из вторичного и третичного генетических пулов (5-9).

Современная селекция картофеля ориентирована на расширение генетического разнообразия источников и доноров хозяйственно ценных признаков и получение на их основе сортов, сочетающих высокую продуктивность с комплексной и групповой устойчивостью к патогенам. Эти задачи решаются на основе использования межвидовой гибридизации и маркер-опосредованного отбора (marker-assisted selection, MAS) (10-12), а также методов биотехнологии (13). Применение MAS кардинально повышает эффективность программ по пирамидированию целевых генов/QTL, детерминирующих устойчивость к патогенам, и позволяет контролировать распространение нежелательных генетических детерминант. Так, интрогрессия R генов устойчивости от мексиканских полиплоидных видов Solanum stoloni-ferum и S. demissum нередко сопровождается передачей гибридам признаков, осложняющих традиционный селекционный процесс (14, 15). Многие гибриды и сорта, обладающие иммунитетом к Y-вирусу картофеля (PVY), одновременно характеризуются мужской стерильностью — формированием полностью стерильных пыльцевых зерен аномальной морфологии (16, 17). Этот признак, затрудняющий подбор пар для скрещиваний, передается по материнской линии от образцов дикого вида S. stoloniferum — источников гена экстремальной устойчивости к YВК Ry_sto (16, 17). Разработаны маркеры, позволяющие идентифицировать митотипы α , β и γ, и установлена статистически значимая связь митотипа γ (тип цитоплазмы W/γ) с цитоплазматической мужской стерильностью сортов и гибридов, в родословных которых присутствует S. stoloniferum (18). Эти результаты нашли подтверждение в работах других исследователей (16, 17). В то же время устойчивые к PVY сорта с цитоплазмой W/α типа чаще всего фертильны (16). Другим примером совместной передачи целевых генов и мужской стерильности может служить наследование гибридами R генов расоспецифической устойчивости к фитофторозу и цитоплазматических детерминант мексиканского вида S. demissum (17, 19). Гибриды и сорта с цитоплазмой D (W/α) от S. demissum формируют пыльцевые зерна нормальной морфологии, которые, однако, функционально стерильны (17, 20). Очевидно, что при передаче различным интрогрессивным формам стерилизующих типов цитоплазмы программы по пирамидированию R генов могут иметь серьезные ограничения.

В настоящей работе на оригинальном гибридном материале продемонстрирована возможность повышения эффективности интрогрессивной гибридизации за счет использования ДНК-маркеров разных типов цитоплазмы вместе с маркерами R генов устойчивости к наиболее вредоносным патогенам картофеля. В MAS вовлекались гибридные клоны, отобранные по устойчивости к патогенам и по морфологическим характеристикам клубней из расщепляющихся популяций двувидовых (простых) и многовидовых гибридов мексиканских полиплоидных видов — S. neoantipoviczii (= S. stoloniferum ) и S. guerreroense (привлечен в селекционный процесс впервые). Для S. guerreroense взаимосвязь мужской стерильности и W/γ типа цитоплазмы показана впервые.

Цель работы заключалась в получении потомств многовидовых гибридов на основе диких полиплоидных мексиканских видов картофеля и их молекулярном скрининге с применением ДНК-маркеров типа цитоплазмы и устойчивости к наиболее вредоносным патогенам — Phytophthora infestans, Y вирусу картофеля и золотистой картофельной нематоде.

Методика. Исходными родительскими формами оригинальных межвидовых гибридов служили образцы мексиканских и южно-американских видов, селекционные клоны и сорта из коллекций ВИР и SLU (Swedish University of Agricultural Sciences, Швеция), выделенные по высокой устойчивости листьев и (или) клубней к фитофторозу и по устойчивости к PVY (2123). Образцы ВИР были представлены клонами мексиканских диких видов S . neoantipoviczii ( =S . stoloniferum ) (к-8505) (nan) с высокой устойчивостью листьев к фитофторозу и устойчивостью к PVY (штаммы PVY⁰, PVY^N-Wi, PVY^NTN), а также S . guerreroense (к-18407) (grr) с устойчивостью к PVY (штаммы PVY⁰, PVY^N-Wi) и высокой устойчивостью листьев к фитофторозу (22). Весьма вероятно, что у S . neoantipoviczii к-8505 ген Ry_sto находится в гомозиготном состоянии, поскольку при индивидуальном анализе у каждого из сеянцев был обнаружен маркер YES3-3A гена Ry_sto (24)_. Южно-американские дикие виды представляли клоны образцов с высокой ( S . microdontum , к-20320) (mcd) и частичной ( S . tarijense , к-10712) (tar) устойчивостью листьев (22, 25), а также клубней ( S . kurtzianum , к-12488) (ktz) к фитофторозу (22). Клоны S . kurtzianum (к-12488) и S . tarijense (к-10712) способны к клубнеобразованию в условиях продолжительного светового дня, их клубни имеют хорошие морфологические характеристики. У культурного андийского вида S . tuberosum subsp. andigenum (к-8077) (adg) у части растений отмечали устойчивость клубней к фитофторозу. Из коллекции SLU были получены следующие селекционные клоны: SW-0906512 — фертильный урожайный клон с хорошими агрономическими характеристиками, проявляет полевую устойчивость к PVY; SW93-1015 — клон неизвестного происхождения, характеризуется полевой устойчивостью к фитофторозу конститутивного типа (26), обусловленной геном R2 like (27), а также устойчивостью к PVY (23), недостаток этого клона — повышенное содержание α-чаконина в клубнях (23); клон NZ2010-10nb, полученный с участием S . sto-loniferum , растения которого проявляют полевую устойчивость к фитофторозу и PVY. Селекционные сорта Campina, Desir e e, Sarpo Mira и Superb (коллекция SLU) использовали в скрещиваниях с целью улучшения агрономических признаков клубней у межвидовых гибридов; сорт Sarpo Mira проявляет высокую устойчивость к фитофторозу. Межвидовые гибриды получены Н.М. Зотеевой; некоторые двувидовые (простые) гибриды ранее охарактеризованы в полевых и лабораторных фитопатологических тестах (28-30). Генотипы, отобранные по устойчивости к PVY и фитофторозу, вовлекались в последовательные скрещивания для создания многовидовых гибридов. Всего в настоящей работе были изучены 35 гибридных клонов (11 комбинаций скрещиваний), которые разделили на три группы, различающиеся исходными материнскими формами — донорами цитоплазматических детерминант.

ДНК выделяли из листьев полевых растений с использованием модифицированного нами СТАВ-метода (31).

Праймеры для молекулярного скрининга гибридов на наличие маркеров генов устойчивости к PVY (16, 32, 33), фитофторозу (27, 34-37) и золотистой картофельной нематоде (38) были отобраны на основании выполненного ранее анализа исходных родительских форм диких мексиканских видов.

Тип цитоплазмы у гибридов определяли по системе K. Hosaka и R. Sanetomo (17) с использованием предложенного ими набора, включающего четыре маркера различных участков пластидной ДНК (локусы ndhC / trnV , rpl32 / trnL-UAG , cemA , rps16 / trnQ ) и маркеры двух участков ми-966

тохондриального генома (локусы rps10 и rps19 ) .

ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 нг тотальной ДНК, 1½ реакционный буфер («Диалат Лтд», Россия), 2,5 мM MgCl₂, 0,4 мM каждого из dNTPs, по 0,2 мкM прямого и обратного праймеров и 1 ед. Taq ДНК-полимеразы («Диалат Лтд», Россия). В случае праймеров ALM4/ALM5 концентрацию dNTPs увеличивали до 0,6 мM. Реакцию осуществляли в амплификаторе Mastercycler^® Nexus Gradient («Eppen-dorf», Германия) при температурах отжига, соответствующих указанным в литературе (см. раздел Результаты ). Для всех маркеров, кроме CAPS, ПЦР повторяли не менее 3 раз, для праймеров ALM4/ALM5 — не менее 5 раз.

Рестрикцию проводили в 30 мкл реакционной смеси согласно протоколам фирмы-производителя (НПО «СибЭнзим», Россия; . Электрофоретическое разделение осуществляли в буфере ТВЕ в 2 % агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в УФ-свете. Стандартом служил маркер молекулярной массы 100 bp + 1500 bp + 3000 bp (НПО «СибЭнзим», Россия).

Фертильность гибридов определяли с использованием общепринятого метода окраски пыльцы ацетокармином и по результатам скрещиваний.

Полевую устойчивость листьев к фитофторозу оценивали в 20142015 годах в условиях сильного распространения инфекции (SLU, Швеция), а также в эпифитотийный сезон 2016 года (экспериментальное поле Пушкинских лабораторий ВИР, Ленинградская обл.). Каждый год оценку проводили в динамике с начала появления инфекции на контрольных неустойчивых сортах (Desire, Bintje; коллекция SLU) и до конца вегетации растений. Использовали шкалу от 1 (целиком пораженное растение) до 9 баллов (отсутствие симптомов болезни).

Полевую устойчивость гибридных генотипов к PVY оценивали в 2012-2014 годах (SLU) на высоком инфекционном фоне (при сильной инвазии тлей в 2012 и в 2014 годах) на необрабатываемых посадках растений. В тех же посадках восприимчивый сорт Magnum Bonum (коллекция SLU) ежегодно проявлял сильные симптомы болезни. Растения без видимых симптомов вирусного поражения оценивали методом иммуноферментного анализа ELISA (Еnsymе-linked immunosorbent assay) с использованием набора фирмы «BIOREBA AG» (Швейцария) согласно инструкции производителя. Абсорбцию измеряли на спектрофотометре Multiskan™ GO Microplate Spectrophotometer («Thermo Fisher Scientific», США). Показатель абсорбции выше 0,1 учитывали как положительную реакцию (чувствительность растений к вирусной инфекции). Ежегодно тесты проводили дважды — в конце июня и в самом начале августа в соответствии с рекомендациями International Potato Center , касающимися возраста растений разных групп спелости.

Результаты . Ранее было показано, что у образца S. guerreroense (к18407) присутствует маркер гена R3а (24), а у S. neoantipoviczii (= S. stolon-iferum ) (к-8505) — маркер гена Ry_sto (24). Поскольку в скрещиваниях участвовали образцы аборигенных и селекционных сортов картофеля, устойчивые к PVY и ЗКН (патотип Ro1), в молекулярный скрининг также были привлечены маркеры генов Ry_adg и H1 .

Условия ПЦР и праймеры, использованные при молекулярном скрининге полученных гибридов картофеля, приведены в таблице 1.

В таблице 2 представлены формулы межвидовых комбинаций, многие из них осуществлены впервые. Как известно, виды картофеля с одинаковыми значениями эффективной плоидности (EBN) относительно легко скрещиваются друг с другом, формируя жизнеспособные гибридные семена (39). К таким комбинациям можно отнести скрещивания тетраплоидного культурного картофеля (EBN = 4) и дикого мексиканского гексаплоидного вида S. guerreroense (EBN = 4), который в классической систематике относят вместе с S. demissum к серии Demissa. Аналогичным образом в комбинации nan ½ (mcd ½ trj) у S. neoantipoviczii (=S. stoloniferum), S. microdontum и S. tarijense, то есть у всех участников скрещиваний, EBN = 2 (см. табл. 2). В более сложных комбинациях правило EBN не соблюдалось, что достаточно часто происходит при получении многовидовых гибридов (9).

1. ДНК-маркеры, ассоциированные с R генами

Ген	Хромосома	Маркер	Последовательность праймера (5'^3')	T m , °С	Размер диагностического фрагмента, п.н.	Ссылка
Ry sto	XII	Уст о йч и в о сть к Y-в и ру су к арт о ф GP122- F: CAATTGGCTCCCGACTATCTACAG		еля 52	406	(32)
Ry-f sto	406/EcoRV YES3-3A		R: ACAATTGCACCACCTTCTCTTCAG F: TAACTCAAGCGGAATAACCC	55	341	(16)
Ry adg	XI	RYSC3	R: AATTCACCTGTTTACATGCTTCTTGTG F: ATACACTCATCTAAATTTGATGG	60	321	(33)
Rpi-blb1	VIII	blb 1	R: AGGATATACGGCATCATTTTTCCGA Устойчивость к фитофторозу F: AACCTGTATGGCAGTGGCATG       58		821	(34)
Rpi-sto1	VIII	Rpi-sto1	R: GTCAGAAAAGGGCACTCGTG F: ACCAAGGCCACAAGATTCTC	65	890	(35)
R 1	V	R1-1250	R: CCTGCGGTTCGGTTAATACA F: CACTCGTGACATATCCTCACTA	65	1205	(36)
R2-like	IV	R2area 1/2	R: GTAGTACCTATCTTATTTCTGCAA- GAATTCTTATTTCTGCAAGAAT F: AAGATCAAGTGGTAAAGGCTGATG	60	1137	(27)
R3a	XI	RT-R3a	R: ATCTTTCTAGCTTCCAAAGATCACG F: ATCGTTGTCATGCTATGAGATTGTT	56	982	(37)
H1	Ус V	тойчиво 57 R	R: CTTCAAGGTAGTGGGCAGTATGCTT сть к золотистой картофельной нематоде F: TGCCTGCCTCTCCGATTTCT          60      452			(38)
R: GGTTCAGCAAAAGCAAGGACGTG П р и м еч а ни е. Tm — температура отжига праймеров.

Молекулярный скрининг гибридов с использованием маркеров различных типов цитоплазмы и маркеров R генов. Гибриды от скрещиваний селекционного клона SW93-1015. Все изученные гибридные клоны из двух комбинаций скрещиваний, полученных на основе селекционного клона SW93-1015 (материнская форма), имели тип цитоплазмы W/ y и полностью стерильную пыльцу аномальной морфологии (см. табл. 2), что указывает на присутствие S. stoloniferum в родословной SW93-1015. В пользу такого предположения свидетельствует и наличие в этом материале характерных для S. stoloniferum маркеров YES3-3A₃₄₁ и GP122-406/EcoRV₄₀6, сцепленных соответственно с генами Ry_sto и Ry-f_sto , которые локализованы на XII хромосоме. Эти маркеры отсутствуют у других родительских форм гибридов в комбинации ¹ 1 — образца S. tuberosum subsp. andigenum к8077 и сорта Desir é e (16, 40). Кроме того, отобранные гибридные клоны имели маркеры гена устойчивости к фитофторозу R2-like и гена устойчивости к ЗКН Н1 (см. табл. 2). Гибриды этой серии могли использоваться в дальнейших скрещиваниях только в качестве материнских форм. По сравнению с исходным селекционным клоном SW93-1015 гибриды из комбинации ¹ 1 (SW93-1015 ½ adg) ½ Desir é e имели большее число клубней на растении, которые были более выравнены по размеру.

Гибриды, полученные в скрещиваниях S. neoantipoviczii ( =S. stolonife-rum ) . Согласно данным литературs, у S. stoloniferum встречаются образцы с типами цитоплазмы W/a и W/ y (41), причем с индукцией мужской стерильности у гибридов и сортов картофеля ассоциирован только второй из них (16-18, 41). Исходной материнской формой гибридов этой серии был образец S. neoantipoviczii (= S. stoloniferum ) к-8505 с типом цитоплазмы W/a. Все полученные на его основе гибриды также обладали цитоплазмой W/a 968

типа и характеризовались разной степенью фертильности пыльцы (26,769,8 %). Гибрид [nan ½ (mcd ½ trj) ½ (grr ½ adg)] успешно использовался в качестве опылителя в дальнейших скрещиваниях, что указывает на функциональную фертильность его пыльцы (см. табл. 2).

2. Результаты молекулярного скрининга и фенотипирования гибридов картофеля в разных комбинациях скрещиваний с полиплоидными дикими мексиканскими видами (по группам в зависимости от исходной материнской формы)

Группа, вариант	Формула комбинаций	Тип цитоплазмы (число изученных сеянцев)	ФП, %	Наличие диагностических фрагментов маркеров R генов у отобранных генотипов									Устойчивость к фитофторозу в 2014-2016 годах, балл
				2		Q 2				2*	2*	2
I	SW93-1015 ( ? )		0	-	+	-	-	-	-	+	+	+	8,0; 8,0; нд
1	(SW93-1015 х adg) х Desir e e	W/γ (3)	0-1,0	-	+	-	-	-	-	+	+	-	нд ; 7,0; 8,0
2	(SW93-1015 ½ adg) ½ {[nan ½ ½ (mcd ½ trj)] ½ (grr ½ adg)}	W/γ (3)	0-0,3	-	+	-	-	-	-	+	+	+	7,0; 6,0; 6,0
II 3.1	S. neoantipoviczii ( ? ) [nan ½ (mcd ½ trj)] ½ (grr ½ adg)	W/α (1)	69,8	-	+	-	+	+	+	+	-	-	7,0; 8,0; 7,0
3.2	[nan ½ (mcd ½ trj)] ½ (grr ½ adg)	W/α (1)	66,7	-	+	-	+	+	+	+	-	-	8,0; 8,0; 6,0
4	[{nan ½ (mcd ½tar)} ½ (grr ½ ½ adg)] ½ SW-0906512	W/α (1)	26,7	-	-	-	-	-	+	+	+	-	6,0; 6,0; 5,5
III 5	S. guerreroense ( ? ) grr ½ adg	W/α (6)	18,0-24,1	-	+	+	-	-	+	-	-	-	8,0; 8,0; 7,0
5.1 6	grr ½ Superb (grr ½ Superb) ½ Sarpo Mira	W/α (4) W/α (3)	38,0-65,0 16,0-16,8	--	+ +	+ +	-	-	+	--	--	--	8,0; 7,0; 8,0 8,0; 7,0; 8,0
7	(grr х Superb) х Desir e e	W/α (1)	14,5	-	-	-	-	-	+	-	-	-	6,5; 6,5; 6,9
8.1	(grr ½ Superb) ½ NZ2010-10nb	W/γ (1)	0,2	-	-	-	+	+	-	+	+	-	6,5; 7,0; 6,0
8.2	(grr ½ Superb) ½ NZ2010-10nb	W/γ (1)	0	-	-	-	+	+	-	+	+	-	7,0; 7,0; 5,5
9	[(grr ½ Superb) ½ NZ2010-10nb] ½ ktz	W/γ (1)	1,0	-	+	+	-	-	+	-	-	-	нд ; 6,5; 7,0
10	[(grr ½ Superb) ½ NZ2010-10nb] ½ {[nan ½ (mcd ½ tar) ½ ½ (grr ½ adg)] ½ SW-0906512}	W/γ (4)	0-0,7	-	-	+	+	+	+	+	+	-	нд ; 7,0; 6,5
11.1	[(grr ½ Superb) ½ NZ2010-10nb] ½ cv. Campina	W/γ (1)	0	-	+	+	+	+	-	+	+	-	нд ; 6,0; 5,0
11.2	[(grr ½ Superb) ½ NZ2010-10nb] ½ cv. Campina	W/γ (1)	0	-	+	+	-	-	-	+	+	+	нд ; 7,0; 7,0
11.3	[(grr ½ Superb) ½ NZ2010-10nb] ½ cv. Campina	W/γ (1)	ОЦ	-	-	-	-	-	-	+	+	-	нд ; 4,0; 1,0

П р и м е ч а н и е. Выполнены три серии скрещиваний (группы в зависимости от использованных исходных материнских форм). Данные о маркерах R генов приведены для отдельных гибридных генотипов, отобранных из расщепляющихся популяций либо по устойчивости к патогенам и (или) морфологическим характеристикам клубней. ФП — фертильность пыльцы у проанализированных генотипов (min-max), ОЦ — отсутствие цветения у растений гибрида 11.3; «+» — маркер выявлен, «-» — маркер не выявлен, нд — нет данных (устойчивость не изучали). Аббревиатуры названий видов картофеля: grr — Solanum guerreroense , ktz — S. kurtzianum, mcd — S. microdontum , trj — S. tarijense , nan — S. neoantipoviczii (= S. stoloniferum ), adg — S. tuberosum subsp. andigenum. Типы цитоплазмы указаны для всех проанализированных генотипов — от 1 до 6 на комбинацию.

Все гибриды II группы имели маркеры R генов экстремальной устойчивости к PVY, а многовидовой гибрид ¹ 4 — маркеры трех таких генов: Ry_adg , Ry_sto , Ry-f_sto (см. табл. 2). Среди многовидовых гибридов этой группы были отобраны генотипы с маркерами генов устойчивости к фитофторозу R2 like , Rpi-blb1, Rpi-sto1 .

Гибриды, полученные в скрещиваниях c S. guerreroense. Вид S. guerrer-oense был вовлечен в селекционный процесс впервые. Растения двувидовых гибридов из комбинаций (grr ½ adg) и (grr ½ Superb), как правило, имели фиолетовую окраску венчика, характерную для S. guerreroense, но в отличие от него формировали клубни в условиях длинного светового дня. Растения гибрида (grr ½ Superb) имели длинные столоны и клубни неправильной формы. В потомстве гибрида (grr х Superb) х Desiree наблюдали большую изменчивость по форме клубней и окраске их кожуры. Растения простых гибридов образовывали большое число ягод при самоопылении. У этих гибридов доля фертильной пыльцы достигала 24 %, а растения гибрида (grr ½ adg) успешно использовались в качестве эффективных опылителей при получении многовидовых гибридов, что указывает на функциональную фертильность их пыльцы (см. табл. 2). Все двувидовые гибриды трех комбинаций — (grr х adg), (grr х Superb), [(grr x Superb) x Desiree] имели W/α тип цитоплазмы. Однако у многовидовых гибридов из III группы (S. guerreroense — исходная материнская форма) был детектирован ми-тотип γ, причем все многовидовые гибриды комбинаций ¹¹ 8-11 оказались стерильными (см. табл. 2). Отсутствие амплификации в межгенном спейсере мтДНК rps10-cob (тип цитоплазмы W/γ) у этих многовидовых гибридов может быть связано с перестройками последовательностей мтДНК, происходящими при многократной гибридизации.

Гибридные клоны из III группы, полученные на основе S. guer-reroense , в разных сочетаниях несли до 4 маркеров генов устойчивости к фитофторозу и от 1 до 3 маркеров генов устойчивости к PVY (см. табл. 2). Донорами гена Ry_adg у отобранных гибридных клонов могли быть сорт Superb или образец S. tuberosum subsp. andigenum к-8077; у многовидовых гибридов в комбинациях ¹¹ 8-11 донорами генов Ry_sto и Ry-f_sto служили либо S. neoantipoviczii (= S. stoloniferum ) (комбинация ¹ 10), либо устойчивый к PVY селекционный клон NZ2010-10nb, в происхождении которого участвовал S. stoloniferum (комбинации ¹¹ 8, 9, 11) (см. табл. 2).

Ни в одной из изученных комбинаций не выявили генотипов с маркером R1-1250 гена R1 (см. табл. 2).

У гибридов из II и III групп при наличии маркера Rpi-sto1 одновременно во всех случаях был детектирован маркер blb1 (ген Rpi-blb1 ) (см. табл. 2). Известно, что гены Rpi-blb1 и Rpi-sto1 — ортологи, относятся к одному семейству Rpi-blb1 , локализованы на VIII хромосоме возле маркера CT88, а их последовательности обладают высокой степенью гомологии (34, 42, 43); сообщается также о функциональной гомологии этих генов (43). Внутригенные маркеры, разработанные для гена Rpi-blb1 диплоидного мексиканского вида S. bulbocastanum , выявлены у образцов мексиканских полиплоидных видов S. stoloniferum и S. papita (= S. stoloniferum ) (34), а также у гибридов, полученных с участием S. stoloniferum (12). Поэтому в нашей работе оба маркера (Rpi-sto1 и blb1), по всей видимости, детектируют у изученных гибридов последовательности одного и того же гена Rpi-sto1 .

Оценка устойчивости гибридов к фитофторозу и PVY. Растения восприимчивых стандартных сортов Bintje и Desir e e сильно поражались фитофторой уже через 2,5 нед после появления инфекции в поле в 2014-2015 годах, а в эпифитотийный сезон 2016 года растения тех же сортов в те же сроки были поражены полностью. В этот же период проходили изучение гибридные клоны, отобранные ранее из расщепляющихся популяций. В условиях эпидемического распространения Ph. infestans в 2016 году была подтверждена устойчивость ряда клонов, полученных в сериях скрещиваний с исходными образцами SW93-1015, S. neoantipoviczii к-8505 и S. guerreroense к-18407 (см. табл. 2). Высокую полевую устойчивость (7-8 баллов) имели двувидовые (простые) межвидовые гибриды в комбинациях ¹¹ 1, 5, 6 (см. табл. 2). В проведенных ранее лабораторных тестах с заражением листьев гибриды комбинации (grr ½ adg) проявляли реакцию сверхчувствительности, как и родительский образец S. guerreroense (24). Из расщепляющихся популяций гибрида grr ½ adg были отобраны генотипы с крайне высокой устойчивостью в тесте заражения листьев тремя разными изолятами Ph. infestans — SW058 (26), 88069 (44) и H7 (45) при концентрации инокулюма, трижды превышающей стандартную (30). На ос-970

новании всех полученных данных можно заключить, что образец S. guer-reroense к-18407 — ценный источник устойчивости к фитофторозу, эффективно передающий этот признак гибридным потомствам. Высокой устойчивостью к фитофторозу также выделялись клоны многовидового гибрида [nan ½ (mcd ½ trj) ½ (grr ½ adg)] (см. табл. 2). При сильном распространении инфекции Ph. infestans в 2017 году устойчивость гибридных клонов, выделившихся в сезоне 2016 года, полностью подтвердилась (данные не приведены).

В результате последовательных скрещиваний гибридов с сортами и (или) селекционными клонами улучшались их агрономические характеристики, но одновременно несколько снижалась устойчивость к фитофторозу. Так, у ряда клонов из комбинаций ¹¹ 7, 8, 9, 10, 11 она составила от 6,0 до 7,0 баллов, а у гибридов ¹ 4 и ¹ 11.1 — от 5,5 до 6,0 баллов (см. табл. 2). Клон ¹ 11.3 был отобран по хорошим агрономическим характеристикам (клубни культурного типа), но его растения полностью поражались фитофторой в 2016 году; у этого генотипа мы не выявили ни одного маркера генов устойчивости к фитофторозу R2 like , R3а, Rpi-blb1, Rpi-sto1 (см. табл. 2).

По результатам молекулярного скрининга в I-III группах комбинаций выделились генотипы, которые в разных сочетаниях несли маркеры генов широкого спектра устойчивости к фитофторозу ( R2 like , Rpi-blb1, Rpi-sto1 ) и расоспецифичной устойчивости ( R3а ). Однако наличие этих маркеров не всегда обусловливало фенотипическую устойчивость гибридов. Например, гибрид ¹ 11.1 имел все четыре маркера генов устойчивости к фитофторозу (см. табл. 2), но демонстрировал среднюю устойчивость к патогену. Вероятно, использованные в анализе маркеры детектировали у подобных генотипов нефункциональные гомологи R генов. В то же время высокая полевая устойчивость к фитофторозу (7-8 баллов) при отсутствии некоторых из маркеров может быть следствием интрогрессии еще не идентифицированных генов/QTL от S. guerreroense (комбинации ¹ 5 и ¹ 7, см. табл. 2) или функционирования у гибридов других R генов (например, гибрид ¹ 6 мог получить доминантные аллели генов R4 , R8 , Rpi-Smira1 от сорта Sarpo Mira) (46, 47).

Полевую устойчивость к PVY оценили у гибридов только в двух комбинациях — ¹ 3 и ¹ 5 и в их потомстве (по 10 сеянцев на комбинацию). В условиях высокого инфекционного фона растения многовидового гибрида [nan ½ (mcd ½ trj)] ½ (grr ½ adg)] не проявляли симптомов поражения PVY в течение всего периода изучения и, согласно данным ELISA, были свободны от вирусной инфекции (величина абсорбции в тесте — от 0 до 0,001). У этого гибрида были детектированы маркеры двух генов экстремальной устойчивости к PVY — Ry_sto и Ry_adg (см. табл. 2). Все изученные клоны в потомстве гибридов комбинации ¹ 3 также характеризовались полевой устойчивостью к PVY в течение всего периода изучения. Растения восприимчивого сорта Magnum Bonum, росшие в тех же посадках, проявляли сильные симптомы болезни c величиной абсорбции в ELISA от 2,19 до 2,37. В комбинации ¹ 5 (grr ½ adg) у гибридов был выявлен RYSC3 — маркер гена Ry_adg , определяющий экстремальную устойчивость к PVY. В потомстве этих гибридов около ³/₄ растений были свободны от вирусной инфекции.

Таким образом, как показали результаты проведенных исследований, из 35 изученных гибридных клонов 17 имели цитоплазму W/α типа, 18 — W/γ типа. Из 18 гибридных генотипов с типом цитоплазмы W/γ 17 формировали полностью стерильные пыльцевые зерна аномальной морфологии, а один генотип не цвел. Признак мужской стерильности и тип цитоплазмы W/γ передавались по материнской линии многовидовым ги- бридам в разных комбинациях скрещиваний. У 17 гибридов с типом цитоплазмы W/α степень фертильности различалась, и некоторые из них использовались в качестве опылителей. Эта закономерность проявлялась как для материала, созданного на основе цитоплазмы S. stoloniferum (I и II группы), так и для гибридов III группы, полученных с участием S. guerroense (материнская форма); в последнем случае митотип γ мог возникнуть в процессе многовидовой гибридизации. Подобная взаимосвязь мужской стерильности и типа цитоплазмы W/γ у селекционных клонов и сортов, созданных с участием S. stoloniferum, продемонстрирована ранее (16, 17). Для S. guerreroense это явление было показано впервые. На основании полученных результатов и данных литературы можно полагать, что при поиске источников устойчивости к патогенам в популяциях S. stoloniferum, S. guerreroense (и, возможно, других мексиканских видов) целесообразно одновременно проводить отбор против доноров стерилизующего типа цитоплазмы W/γ, нежелательного для традиционного селекционного процесса. Напротив, отбор клонов с типом цитоплазмы W/α позволит увеличить вероятность получения интрогрессивных форм с мужской фертильностью. Не исключено, что в будущем вектор отбора изменится, поскольку фиксация в селекционном материале генотипов со стерилизующими типами цитоплазмы может оказаться перспективной для развития нового направления — гетерозисной гибридной селекции картофеля (48).

Итак, совместное использование двух систем ДНК-маркеров — ядерных, ассоциированных с R генами устойчивости, и цитоплазматических, детектирующих разные типы цитоплазмы, позволяет повысить результативность подбора пар для гибридизации, контролировать и заранее планировать направления скрещиваний, снижая затраты времени и средств при объединении в генотипе генов, детерминирующих один и тот же или разные хозяйственно ценные признаки.