Использование молекулярных маркеров, связанных с устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам среды при создании селекционного материала томата и перца в Беларуси

Оригинальная статья / Original article

У стойчивость к воздействию неблагоприятных факторов – необходимое условие успешного возделывания культурных растений. Способность растительного организма к эффективной защите от негативных воздействий среды является важнейшим резервом повышения урожайности, поскольку обеспечивает возможность максимальной реализации потенциала продуктивности. В этой связи повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к неблагоприятным факторам среды биотической и абиотической природы неизменно остается важной и актуальной задачей генетико-селекционных исследований [1].

Серьезный экономический ущерб возделыванию овощных культур наносят патогены, которые вызывают многочисленные болезни растений. Применение химических методов борьбы с инфекциями не всегда дает желаемые результаты и снижает качество продукции, нанося вред окружающей среде и здоровью человека.Перспективным способом защиты растений является создание и выращивание устойчивых форм,которые невосприимчивы к воздействию патогенов.Поиск генетических детерминант устойчивости и ДНК-маркеров к ним позволяет с применением инструментов маркер-ассоции-рованной селекции (МАС) создавать генотипы, способные противостоять разнообразным негативным воздействиям. В литературе опубликованы сведения о идентификации генов,связанных с сопротивляемостью биотическим стрессам у томата и перца, и о разработанных к ним молекулярных маркерах. Выявлены гены, контролирующие устойчивость к ряду экономически значимых заболеваний, вызываемых возбудителями грибной, бактериальной, вирусной природы и нематодой [2-12].

В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси проводится работа с ДНК-маркерами генов устойчивости к болезням и вредителям пасленовых,которая направлена на апробацию, адаптацию, верификацию представленных в литературе маркеров. С применением методов ДНК-маркирования ведется скрининг коллекционного и селекционного материала для выявления источников целевых аллелей и создания новых устойчивых генотипов [13-15].

Не менее важна для сельскохозяйственных культур, особенно выращиваемых в зонах рискованного земледелия, устойчивость к негативным абиотическим факторам. К генетическим детерминантам, ассоциированным с неспецифической устойчивостью к стрессам, относят гены, связанные с регуляцией синтеза антоциановых пигментов.Имеются све- дения, что растительные организмы с повышенным содержанием флавоноидов в тканях более устойчивы к неблагоприятным воздействиям среды [16-18].

В литературе и генетических базах данных представлены сведения по идентификации генов, кодирующих Myb транскрипционные факторы (ТФ), участвующие в регуляции биосинтеза антоцианов у томата: Anthocyanin1, доминантный аллель которого Ant1 из S. chilense увеличивает количество флавоноидов в плодах, An2 и An2-like, которые тесно сцеплены с Ant1. [16, 19]. Ген Atroviolacеa (ATV), рецессивный аллель которого (atv) из S. cheesmaniae связан с активным накоплением антоциана как в плодах (наряду с Ant1, An2), так и в вегетативных органах [20]. Для идентификации указанных генов предложены ДНК-маркеры, позволяющие дифференцировать аллели Ant1/ant1, Atv/atv. [19-20].

В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси разработаны новый SCAR Ant1.1 (FAM) маркер для выявления аллелей Ant1 и ant1 , SCAR маркеры An2-AFT(ОM) и An2-4F/R для генотипирования аллелей гена An2: An2-Aft, An2-Ins57 и Myb75, SCAR маркер Atv2 для дифференциации аллей гена Аtv ( Atv/atv ). Выполнены исследования по изучению накопления антоцианов в различных частях растений томата в зависимости от комбинации аллелей [21].

У Capsicum annuum выявлены наиболее схожие по нуклеотидному составу и функциям с геном Ant1 S . lycopersicum последовательности генов Мyb113-like 1 и Мyb113-like 2 , установлены генетические полиморфизмы этих генов,приводящие к изменению структуры кодируемого белка и нарушению процесса биосинтеза антоцианов в плодах и вегетативных органах, разработаны молекулярные маркеры для типирования выявленных аллелей ( Myb113-like1-delT, Myb113-like1-promIns148, Myb113-like1-prоmIns2, Myb113-like2-(C/A )) [22-23].

В данной работе дана характеристика используемых молекулярных маркеров, представлены результаты ДНК-типирования с их применением на коллекциях образцов томата и перца для использования в генетических исследованиях, а также для сопровождения селекционного процесса, направленного на повышение устойчивости к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам.

Материалы и методы

Материалом для исследований на различных этапах были формы томата и перца для защищенного и открытого грунта коллекций Института генетики и цитологии НАН Беларуси, Белорусской государственной сельскохозяйственной академии, а также коллекции, используемые при выполнении совместных проектов с Федеральным научным центром овощеводства, Всероссийским институтом генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова, Научноисследовательским институтом плодоовощевод-ства., Научно-исследовательского института плодо-овощеводства им. Л. Димитровой (Республика Куба). В работе использовались молекулярно-генетические методы выделения ДНК, ПЦР-анализ, рестрикция, оценка продуктов амплификации и рестрикции в агарозном или полиакриламидном гелях [13].

Результаты и обсуждение

На основании литературных данных проведены исследования по апробации,адаптации и верификации имеющихся маркеров, связанных c устойчивостью к болезням и вредителям у томата и перца.В таблицах 1 и 2 представлены данные о используемых маркерах по литературным источникам и выполненной верификации.При апробации указанных в таблице 1 маркеров устойчивости к болезням томата были использованы коллекционные образцы, а также близкородственные дикие виды.

Таблица 1. Наименование и характеристика маркеров, используемых для ДНК-типирования образцов S. lycopersicum Table 1. Name and characteristics of markers used for the DNA typing of S. lycopersicum samples

Ген	Тип и название маркера	Праймеры для ПЦР	Т отжига, ºС	Размер ПЦР продукта, п.н.	Литературный источник
Mi-1	SCAR, Mi-1.2	Mi23F: TGGAAAAATGTTGAATTTCTTTTG Mi23R: GCATACTATATGGCTTGTTTACCC	55	R - 380; S - 430	Seah S. et.al., 2007
Mi-9	SCAR, C8B-Mi9	F: ACCCACGCCCCATCAATG R: TGCAAGAGGGTGAATATTGAGTGC	59	R - 400; S - 360	El-Sappah A. H., 2019
Ve	CAPS, Ve ( XbaI )	F: CGAACTTGAC TACATTGACC CTG R: CAGTCTTGAAAGGTTGCTCAGCC	59	R - 410, 332; S - 410, 310, 22	Je Min Lee et.al., 2015
I-2	SCAR, I-2	I-2/5F: CAAGGAACTGCGTCTGTCTG I-2/5R: ATGAGCAATTTGTGGCCAGT	55	R ( I-2 ) - 633; R ( I-2C ) - 566; S - 693, 760	Davis R.M. et al., 2010
I-3	SCAR, P7-43D	F: GGTAAAGAGATGCGATGATTATGTGGAG R: GTCTTTACCACAGGAACTTTATCACC	60	R - 875; S - 650	Je Min Lee. et al., 2015
I-7	СAPS, I-7 ( AgeI )	F: AAGAAGTTCCCTTCTTCCCTTA R: GGAATAACCAAGGGGGTGTT	56	R - 608, 200; S - 808	Je Min Lee. et al., 2015
Cf2, Cf5	SCAR, 2-5Cf	F: GCTATCTTTGGGTATCAACTT R: AGATGACATCGACAAAATGTG	58	R ( Cf-2 ) - 1600; R ( Cf-5 ) - 1163, 880; S - нет продукта	Kanwar J.S. et al., 1980
Cf5	SCAR, CF5	F: GTAATATCAGTGACCTTCACA R: ATTTTCCAAACTGAAAAG	55	R - 1600; S - нет продукта	Dixon M.S. et al.,1998
Cf4	SCAR, Cf4/4A	F: TTACGACAGAAGAACTCTTTCTTGG R: AGTCCGCTTACGTTGGATGG	55	R ( Cf-4 ) - 816; R ( Cf-4A ) - 965; S - нет продукта	Parniske M. et al., 1997 Takken F.L. et al., 1998
Сf9	SCAR Cf9/9DC	CS5: TTTCCAACTTACAATCCCTTC DS1: GAGAGCTCAACCTTTACGAA CS1: GCCGTTCAAGTTGGGTGTT	55	R ( Cf-9 ) - 378; R ( 9DC ) - 507; S - нет продукта	Van der Hoorn R.A. et al., 2001
Ph-2	CAPS, dTG63 ( HinfI )	F: CTACTCTTTCTATGCAATTTGAATTG R: AATAATTTTCAACCATAGAATGATT	55	R - 246; S - 220	Panthee D.R. et al., 2012
Ph-3	SCAR, NC-LB-9-6678	F: CCTTAATGCAATAGGCAAAT R: ATTTGAATGTTCTGGATTGG	52	R - 600; S - 900	Panthee D.R. et al., 2012
Pto	СAPS, Pto_RsaI	F: ATCTACCCACAATGAGCATGAGCTC R: GTGCATACTCCAGTTTCCAC	56	R - 552; S - 113, 439	Je Min Lee. et al., 2015 Yang W. et al., 2005
Rx4	SCAR, pcc12 InDel	F: TCCACATCAAATGCGTTTCT R:TTCCAATCCTTTCCATTTCG	60	R - 113; S - 119	Yang W. et al., 2005
Tm1	SCAR, Tm1:8рог	F: CCACTGTATGATTTCTGCTAGTGAA R1: AGCTTTAACAAATATAAGAATAAAGAC R2: GCAAGCTAAGGTTTACATATATGCC	56	R - 131; S - 212	Je Min Lee. et al., 2015
Тm-2	CAPS, Tm2RS-f3/r3_ HpaI	F: TGGAGGGGAATATTTGTGGA R: ACTTCAGACAACCCATTCGG	61	R ( Tm2 ) - 458, 245; S - 703	Shi A. et al., 2011
Тm-22	CAPS, Tm2RS-f3/ r3_BsiHKAI	F: TGGAGGGGAATATTTGTGGA R: ACTTCAGACAACCCATTCGG	61	R ( Tm22 ) - 358, 353; R (Tm2) - 703	Shi A. et al., 2011
Sw-5	SCAR, Sw5-2	F: CGGAACCTGTAACTTGACTG R:GAGCTCTCATCCATTTTCCG	60	R ( Sw-5b ) - 541; S - нет продукта	Shi A. et al., 2011
Ty2	SCAR, Ty-2	F: TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC R: AGTGTACATCCTTGCCATTGACT	50	R - 900; S - 790	Je Min Lee. et al., 2015
Ty3	SCAR, Ty-3	F: GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC R: GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC	50	R ( Ty-3 ) - 450; R ( Ty-3a ) - 630; S - 320	Je Min Lee. et al., 2015

Рис.1.ДНК-типирование аллелей устойчивости к болезням у форм томата:гена Ty-3 (А), гена Ph-3 (Б)гена I-2 (В), гена Ve (Г

По большинству апробированных маркеров были подтверждены размеры ожидаемых фрагментов, подобраны оптимальные температуры отжига, выполнена адаптация под используемые наборы реагентов. На рис. 1 показаны результаты электрофоретической разгонки продуктов ПЦР при оценке материала по аллелям устойчивости к вирусу желтой курчавости листьев (А), фитофторе (Б), фузарио-зу (В) и вертициллезу (Г).

Анализ коллекций томата на устойчивость к мелойдогинозу, позволил выявить образцы с аллелями устойчивости гена Мi-1 у различных форм для защищенного и открытого грунта. При этом устойчивые образцы c R-аллелем гена Mi-9 чаще были характерны для детерминантных форм, используемых для возделывания в открытом грунте.

Фитофтороз ( late blight ), вызываемый грибами класса Oomycetes рода Phytophtora , является наиболее опасной болезнью для томата в условиях Беларуси. В связи с этим выполнен анализ широких коллекций томата на наличие источников устойчивости по генам Ph-2 и Ph-3 , дана оценка эффективности представленных в литературе маркеров [15], рис.1 Б.

Устойчивость к фузариозному увяданию томата, вызываемому Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici, оценивалась с помощью маркеров I-2, P7-43D, I-7_AgeI (табл.1), связанных с резистентностью к определенным расам возбудителя.Анализ образцов белорусской и российской селекции с помощью маркера I-2 в наших исследованиях позволил идентифицировать два R-аллеля I-2 (633 п.н.) и I-2C (566 п.н.), причем аллель I-2C , как правило, был характерен для индетерминантных форм томата черри.

Исследования образцов кубинской коллекции выявили наличие отличного,не описанного авторами фрагмента около 900 п.н. (рис.1 В, номера образцов 10-12, Lyto).

Бурая пятнистость листьев томата, или кладоспо-риоз, вызываемая грибом Cladosporium fulvum Cke., является одним из наиболее вредоносных заболеваний томата защищенного грунта. Устойчивость к кладоспориозу является непременным требованием при создании современных сортов и гибридов. В наших исследованиях широко использованы доминантные маркеры к генам Cf2, Cf4, Cf5, Cf9. Кроме того, нами апробирован кодоминантный маркер Cf8/CR12 [3] к аллелям гена Сf-9. При сопоставлении результатов, полученных с помощью доминантных маркеров и кодоминантного,выявилось несоответствие размеров ПЦР продуктов, заявляемых авторами по кодоминантному маркеру. Согласно авторам, размеры фрагментов у устойчивых / восприимчивых образцов составляют 1500/1600 п.н. [3], согласно нашим полученным данным – 1675/1909 п.н. соответственно. На рис. 2 представлены результаты ДНК-типирования форм томата с применением SC AR маркеров C f9/9DC (А) и Cf8/CR12 (Б). Использование широких коллекций форм позволило показать, что по большинству образцов результаты типирования обоими маркерами совпадают, однако ряд образцов показали различные результаты. Так у образца кубинской коллекции №24 (L33/1) наряду с фрагментом, характеризующим наличие восприимчивого аллеля, маркер Cf8 /CR12 позволил выявить фрагмент размером 1500 п.н., нехарактерный для других образцов.

Рис.2.ДНК-типирование аллелей гена CF9у форм томата белорусской и кубинской селекции маркерами Cf9/9DC (А)и Cf8/CR12 (Б)

Таблица 2. Наименование и характеристика маркеров, используемых для ДНК-типирования образцов рода Capsicum Table 2. Name and characteristics of markers used for the DNA typing of Capsicum genus specimens

Ген	Тип и название маркера	Праймеры для ПЦР	Т отжига, ºС	Размер ПЦР продукта, п.н.	Литературный источник
Me1	CAPS, C2At2g06530-F/R_ HpyCH4IV	F: TTGGTGCTGTAAGGGACTAAA R: TCTTAATCAATCATTCACACAGCA	55	R - 119; S - 55, 59	Uncu A.T. et al., 2015
Phyto.9 QTL	CAPS, F/R_MvaI	F:CCAACCCTATTGAACGTCTT R:CTGATTCTTGATGCCTCTTG	55	R - 700, 150; S - 850	Kim H. et al., 2008
Phyto.5.2 QTL	SCAR, OpD04.717-F/R	F: CCATAAGGGTTGGTAAATTTACAAAG R: TCGAGAGATAATTCAGATAGTATAATC	55	R - 717; S - нет продукта	Quirin E.A. et al., 2005
Хр.5, QTL	STS, InDel_F/R	F: GGTATCTTATTTCATAGGGACCAGGCA R: TTTGCGGTAGTGACAACAACTTTACAGCCA	55	R - 100; S - 90	ChunYing S. et al., 2015
pvr1	CAPS, PVRL-F/R_ Bse NI	F: TGAGGCAGATGATGAAGTTGA R: CAACCATAAATATACCCCGAG	60	R - 710; S - 580, 130	Paran I. et al., 2009
Cvr1	CAPS, CVMV3-F/R_EcoRI	F: GAACCTCAATCATCTTAGCA R: ACATCAAATTGTTGCATTATAC	55	R - 311, 466; S - 762	Lee H.R. et al., 2013
Cmr1	CAPS, CaTm-int1-F/R_HinfI	F: TCAGCAAAGAAAGATTCACGAAC R: ACGTACACTTGATGATGCCTTGT	58	R - 336, 160; S - 496	Kang W. Et al., 2010
Tsw	CAPS, SCAC568-F/R_XbaI	F: GTGCCAGAGGAGGATTTAT R: GCGAGGTGGACACTGATACT	55	R - 300, 268; S - 568	Özkaynak E. et al., 2014
Bs3	PR-Bs3-F/R	F: GCACACCCTGGTTAAACAATGAACACG R: GATGATAACTTGAAGTTGTGAGGATGG	58	R - 97; S - 110	Römer P. et al., 2010

В таблице 2 представлены данные по 9 маркерам, которые были успешно апробированы, а также по которым найдены источники устойчивости среди образцов изучаемых коллекций: к корневым нематодам ( Meloidogyne spp.: M. incognita, M. javanica, M. arenaria ) – Me1 ; к корневым и плодовым гнилям, вызываемым Phytophthora capsici – Phyto.9, Phyto.5.2, QTLs; к антракнозу, вызываемому Colletotrichum acutatum – хромосома 5, QTL; к Y вирусу картофеля – pvr1; к вирусу огуречной мозаики – Cmr1 ; к вирусу пятнистого увядания TSWV – Tsw ; к вирусу крапчатости сосудов чили – Cvr1 ; к бактериальной пятнистости – Bs3.

По результатам оценки материала выявлены образцы c маркерами устойчивости к корневым нематодам (к мелойдогинозу): C. annuum Л-97, Златозар, Шоколадная красавица, Л-160-10, Фиолетовый красавец и др., к фитофторе плодов: C.annuum Златозар, C. chinense Хабанеро, C. baccatum

Маленький принц; к корневым гнилям, вызываемым Phytophthora capsici – C.annuum МТПЕ053, МТПЕ137, МТПЕ154, МТПЕ204, МТПЕ209, C.chinense Огненная дева, Хабанеро; к антракнозу: C.chinense Огненная дева, Хабанеро; к Y вирусу картофеля: C.annuum ZongKao, F 2 Премьер, F 2 Валентина, F 2 Корнелия, к вирусу огуречной мозаики: C.chinense Огненная дева; к вирусу пятнистого увядания TSWV : C. chinense Хабанеро; к вирусу крапчатости сосудов чили: C. annuum Златозар, ZongKao, Требиа F 2 , Джемини F 2 , МТПЕ 006, МТПЕ 196, C. baccatum Маленький принц, C. chinense Огненная дева, Хабанеро; к бактериальной пятнистости: образцы европейской селекции EVA_Ca_№20, 26, 111, 128 и др. На рис. 3 представлены примеры ДНК-типирования образцов по генам, связанным с устойчивостью к Y вирусу картофеля (А), вирусу крапчатости сосудов чили (Б), мелойдогинозу (В), вирусу огуречной мозаики (Г).

Рис.3.ДНК-типирование аллелей устойчивости к болезням у форм перца:гена pvr1 (А), гена Cvr1 (Б), гена Me1 (В), гена Cmr1 (Г

Второй группой маркеров, связанной с общей устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам, являются маркеры аллелей, участвующих в регуляции накопления антоцианов в растениях.В таблице 3 представлены апробированные и разработанные маркеры, позволяющие выделять формы с накоплением / отсутствием халкон-нарингенина (SC AR MYB12-603del) и антоцианов (CAPS и SCAR маркеры к генам Ant1, An2, ATV, An2-like ) в плодах.

В представленных ранее наших исследованиях на основе данных молекулярного маркирования аллелей генов Ant1, An2 , atv в популяциях F 2 -F 3 изучаемых гибридов и оценки фенотипического проявления признаков на различных этапах онтогенеза,связанных с накоплением антоцианов в растениях, показаны высокая эффективность разработанных молекулярных маркеров, тесное сцепление аллелей генов Ant1 и An2 ( Ant1 и An2-Aft, ant1 и Myb75 ). Подтверждено повышение накопления антоцианов в плодах и вегетативных органах при усилении потока солнечного света, а также при понижении температуры в конце вегетационного периода. Выявлены особенности накопления антоцианов в растениях томата в зависимости от аллелей генов Ant1, An2, Atv. Показано максимальное накопление антоцианов в вегетативных органах и плодах у образцов с аллелями Ant1/An2-Aft/atv в генотипе [21].

Наряду с описанными ранее, в таблице 3 представлены маркеры к аллелям гена An2-like , разработанные по результатам секвенирования данного гена у форм с различным накоплением антоцианов в кожице плодов, которые позволяют разделить образцы с высоким и низким накоплением антоцианов. Данный ген входит в комплекс генов R2R3Myb транскрипционных факторов и тесно сцеплен с геном Ant1 . На рис. 4 показаны результаты ДНК-типирования форм томата с высоким (Октябрята, Бурштын, Дзiвосны: №1-6), и низким накоплением антоцианов (ИСИ63, Дачный: №7-10) в плодах с помощью SCAR маркера SlAn2-like и dCAPS SlAn2-like-AvaI маркера. SCAR маркер подобран к области гена,охватывающей делеции 3и 6 п.н.в четвертом экзоне, приводящие к выпадению трех аминокислот в белке. Маркер dCAPS SlAn2-like-AvaI подобран к SNP-замене C/А в третьем экзоне, приводящей к аминокислотной замене лейцина у диких форм (без накопления антоциана)на метионин у форм с фенотипом Aft. Данная замена расположена в области второго ДНК-связывающего домена синтезируемого белка. Считаем, что данная замена, а также выпадение трех аминокислот вносят вклад в функциональность синтезируемого протеина и, как следствие, в регуляцию накопления антоцианов в плодах.

Таблица 3. Наименование и характеристика маркеров, связанных с накоплением антоцианов, используемых для ДНК-типирования образцов S. lycopersicum

Table 3. Name and characteristics of markers associated with anthocyanin accumulation, used for the DNA typing of S. lycopersicum samples

Ген	Тип и название маркера	Праймеры для ПЦР	Т отжига, ºС	Размер ПЦР продукта, п.н.	Литературный источник
SlMyb12	SCAR, MYB12-603del -aF1/aR6 и MYB12-603del -aF1/aR5	F1: GTGACGAACAACCGAACCTAGAATAA R5: ATTCTAGCGTTATCAGTCGGCATACA R6: GCGGACAAAGTTAATTGGTCACTCA	60	Y - 950, 614; y - 347	Veerappan K. et.al., 2016
Ant1	CAPS, Ant1-NcoI	F: GGAAGGACAGCTAACGATGTG; R: GTTGCATGGGTGGTAAATTAAG	55	Ant1 - 478; ant1 - 271, 207	Sapir M. et.al., 2008
Ant1	SCAR, Ant1.1(FAM	F: TTCATTGGGAGTGAGAAAAGGTT R(FAM): AACTTGCATGCCTGTTGCCTA	58	Ant 1 - 340; ant1 - 344	Babak O.G. et al., 2024
An2-Aft	SCAR, An2-AFT	F: ATTACAAGTGTCATTTTGTGGAAAG R (FAM): AAACTTTTGAATGAAATAATTGC	51	An-Aft - 661; Myb 75 - 647; Ant-Ins - 659	Бабак. О.Г. и др., 2024
An2-Aft	SCAR, An2-4	F: ACTTCACAAACTCTTAGGCAATAG R: AGTCTACCAGCAATAAGTGACCAC	61	An-Aft - 186; Myb 75 - 580; Ant-Ins - 647	Бабак. О.Г. и др., 2024
An2-Like	SCAR, SlAn2-like	F: ACACACACCTACACAAGAAGTT R: GTTGTTCGTCATCTTTGTCTAAT	58	Aft - 204 wt - 213
	dCAPS, SlAn2-like-AvaI	F: CGTTCAACCCACAAATCCCC R: AAGTCTCAAAATGAGATCTATTTCATCCC	59	Aft - 161 wt -131
ATV	SCAR, ATV-In	F(FAM): GAGGTTTCTTCGTTGGTAGTC R: CTAAATAAAAGTTATTGAGTTCACG	53	Atv - 81; atv - 85.	Cao X. et al., 2017
	SCAR, Atv2	F: GTTGGATAAGTAAGAATGTTGTAGA R: CTTCTGAAAGTACATAAACCACA	55	Atv - 460; atv - 852	Бабак. О.Г. и др., 2024
	M 1    2 3    4 5    <	5   7   8 9   10 М        М 1	2 3	4 5 6 7	8 9 10

Таблица 4. Наименование и характеристика маркеров, используемых для ДНК-типирования образцов C. annuum Table 4. Name and characteristics of markers used for the DNA typing of C. annuum samples

Ген, полиморфизм	Тип и название маркера	Праймеры для ПЦР	Т отжига, ºС	Размер ПЦР продукта, п.н.	Литературный источник
Myb113-like1, delT	CAPS, Myb113-AccI F / R	F: ATGCAGATGGTCACTTATGGCT R: ATGAATTTTTGAACCCCTACAGCAA	60	Aft - 589, 25; delT - 393, 195, 25	Бабак О.Г. и др., 2019
Myb113-like1, prom Ins148	SCAR, Myb113-like1-promIns148 F / R	F: TCCGCCCCTCGTTAATTT R: AGCAGGAACAAGATGCCACT	55	Aft - 700; Ins 148 - 848	Бабак О.Г. и др., 2022
Myb113-like1, prоm Ins2	SCAR, PromIns2-F(FAM)/R,	F: TTTTAATATTACGTTAATTTGGGAACG FAM R: AATTAGGCGGGTTAGCCTCA	59	prоmIns 2 - 241; без вставки - 239	Бабак О.Г. и др., 2022
Myb113-like2, SNP C/A	dCAPS, Myb113-AciI F / R	F(FAM): AAAGTACAATACTGCCCTCAAGATCACCG R: GACGACGTTTCACTTGTGAGC	60	Aft (C) - 170, 28 ; wt (A) - 198	Бабак О.Г. и др., 2019
MYB-like ETC3-2, del C и SNP С/G	CAPS, OGF_PagI	F: AGCTATGCTTCACTAGCTCACC R: TCACTGCCTCTTTCGCATCT	60	Aft - 284 и 61; wt - 345

В таблице 4 представлены маркеры, разработанные к генам Myb113-like1 и Myb113-like2 перца, являющимся аналогами томатному гену Ant1 . Ранее представлено описание полиморфизма данных генов,выявленно-го по результатам секвенирования, и его связи с фенотипом Aft (накопление антоцианов в плодах на стадии технической спелости, а также в вегетативных органах, чаще всего в междоузлиях стебля и жилках листьев) [22, 23]. Как правило, фенотип Aft характерен для форм со следующими размерами маркируемых областей у гена Myb113-like1 : 589 п.н. и 25 п.н. (CAPS маркер Myb113-AccI), а также 700 п.н. (SCAR, Myb113-like1-promIns148); у гена Myb113-like2 – 170 п.н. и 28 п.н. (dCAPS маркер Myb113-AciI) [22-24], рис.5 А, Б, В.

В настоящее время основное количество возделываемых сортов перца не накапливают антоцианы в плодах, при этом у большинства из них наблюдается накопление антоцианов в междоузлиях стебля. В нашей изучаемой коллекции накопление антоцианов в междоузлиях стебля не зависело от описанных выше полиморфизмов генов Myb113-like1 и Myb113-like2 . При этом в последовательности гена Myb113-like1 сорта

Златозар, фенотип которого характеризовался полным отсутствием антоцианов в плодах и вегетативных органах, обнаружена наряду с описанными выше маркируемыми полиморфизмами, нарушающими синтез антоцианов, инсерция размером 2 п.н. в промоторной области [24]. Для типирования данной инсерции разработан ДНК-маркер MYB113-like1-prоmIns2, для чего были подобраны праймеры PromIns2-F(FAM)/R (табл.4). Отличным от других образцов в изучаемой коллекции был сорт Блондин, который по разработанным маркерам характеризовался наличием аллелей генов Myb113-like1 и Myb113-like2 без нарушения синтеза антоцианов и, предположительно, мог проявлять фенотип Aft, при этом он характеризовался полным отсутствием синтеза антоцианов во всех частях растения. Данный сорт также характеризовался бледно-зеленой окраской вегетативных органов и светлой оранжевокрасной окраской плодов. Такие фенотипические признаки могут говорить о возможных нарушениях в генотипе, связанных с синтезом пигментов в целом.

Наряду с поиском генов-гомологов Ant1 томата, у перца был осуществлен поиск гена-гомолога ATV

Рис.5.ДНК-типирование аллелей генов, связанных с накоплением антоцианов у перца: Myb113-like1-delT/TT(A),Myb113-like1-promIns148(Б),Myb113-like2-(C/A)(В), ETC3-2 (Г)

Myb113-like1-delT/TT (A),Myb113-like1-promIns148 (B),Myb113-like2-(C/A)(С),ETC3 -2 (D)

( Atroviolaceae ). Одним из выделенных генов - кандидатов является ген ETC3-2 MYB-like ТФ ETC3-2 (GenBank -XM_016723933). По результатам секвенирования последовательностей данного гена у представителей рода Capsicum у формы с максимальным накоплением антоцианов в вегетативных органах, венчике цветка и плодах (OGF) выявлены отличные от других образцов изменения в структуре гена ETC3-2 : однонуклеотидная делеция ( del C ) и SNP-замена С/G перед старт кодоном в первом экзоне гена (м-РНК XM_016723933), приводящие к образованию более раннего старт-кодона, а также однонуклеотидная делеция в первом экзоне ( del T ), приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию раннего стоп-кодона во втором экзоне. Данные изменения приводят к формированию новой короткой белковой последовательности и нарушению функций гена, в результате чего возможно активное накопление антоцианов во всех частях растения. Для выявления полиморфизма, связанного с высоким накоплением антоцианов в вегетативных и генеративных органах к del C и SNP С/G разработан CAPS маркер OGF_PagI (табл. 4). На рис. 5 Г показаны размеры маркируемых фрагментов: у образца OGF – 284 п.н., у форм с ненарушенной последовательностью гена – 345 п.н.

Заключение

По результатам апробации и верификации выделен комплекс наиболее эффективных представленных в литературе ДНК-маркеров, связанных с устойчивостью к возбудителям грибных,бактериальных, вирусных инфекций и нематодам у томата и перца. Отобраны образцы,являющиеся донорами аллелей резистентности к возбудителям болезней.

На основании оценки полиморфизма генов MYB транскрипционных факторов, связанных с регуляцией накопления флавоноидов (халкон-нарингени-на, антоцианов), разработаны молекулярные маркеры, позволяющие дифференцировать образцы томата и перца по накоплению антоцианов в плодах и вегетативных органах. Представлены результаты разработки новых молекулярных маркеров,связан-ных с накоплением антоцианов у томата к аллелям гена An2-like и у перца к аллелям гена ETC3-2 . С применением системы разработанных ДНК-маркеров выделены образцы для использования в селекционном процессе, направленном на повышение устойчивости к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды.

16. Liu Y., Tikunov Y., Schouten R.E., Marcelis L., Visser R., Bovy A. Anthocyanin biosynthesis and degradation mechanisms in Solanaceous Vegetables: a review. Frontiers in Chemistry. 2018;6(52):1–17.

(In Russ.)

(In Russ.)

Об авторах:

Ольга Геннадьевна Бабак ‒ кандидат биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, SPIN-код: 8702-4355, ,

Елизавета Валерьевна Дрозд – младший научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, ,

Наталья Александровна Некрашевич – научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, SPIN-код: 8288-8067, ,

Наталья Владимировна Анисимова – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, SPIN-код: 3000-1523, ,

Констанция Константиновна Яцевич – научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси,

,

Павел Владимирович Шестерень — студент магистратуры Университета Национальной академии наук Беларуси, ,

Ирина Евгеньевна Баева ‒ кандидат с.-х. наук, зав. учебно-научно-исследовательской генетической лабораторией Белорусской государственной сельскохозяйственной академии, SPIN-код: 8736-7550, ,

SPIN-код: 1917-9851,

,

Ирина Геннадьевна Пугачёва ‒ кандидат с.-х. наук, доцент кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, экологии и радиологии Белорусской государственной сельскохозяйственной академии, SPIN-код: 3875-8999, ,

Михаил Михайлович Добродькин – кандидат с.-х. наук, доцент кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, экологии и радиологии Белорусской государственной сельскохозяйственной академии, SPIN-код: 2238-2173, ,

Александр Владимирович Кильчевский ‒ академик НАН Беларуси, доктор биологических наук, профессор, научной руководитель лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, SPIN-код: 2496-4294, ,

Aboutthe Authors:

Olga G.Babak – Cand. Sci. (Biology), Assistant Professor, Leading Researcher of the Laboratory of Ecological Genetics and Biotechnology,

Institute of Genetics and Cytology of National Academy of Science of Belarus,

SPIN-code: 8702-4355, ,

Elizaveta V. Drozd – Junior Researcher of the Laboratory of Ecological Genetics and Biotechnology, Institute of Genetics and Cytology of National Academy of Science of Belarus, ,

Natalya A. Nekrashevich – Researcher of the Laboratory of Ecological Genetics and Biotechnology, Institute of Genetics and Cytology of National Academy of Science of Belarus, SPIN-code: 8288-8067,

,

Natalya V.Anisimova – Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher of the Laboratory of Ecological Genetics and Biotechnology, Institute of Genetics and Cytology of National Academy of Science of Belarus,

SPIN-code: 3000-1523,

Kаnstantsyia K. Yatsevich – Researcher of the Laboratory of Ecological Genetics and Biotechnology, Institute of Genetics and Cytology of National Academy of Science of Belarus, ,

Pavel V. Shesteren – Master’s degree student, University of the National Academy of Sciences of Belarus,

,

Iryna Е. Bayeva – Cand. Sci. (Agriculturе), Chief of the Academic-scientific-investigation Genetics Laboratory, Belarusian State Agricultural Academy,

SPIN-code: 8736-7550,

,

Natalya A. Nevestenko – Cand. Sci. (Agriculturе), Senior Lecturer of the Department of the Agricultural Biotechnology, Ecology and Radiology, Belarusian State Agricultural Academy, SPIN-code: 1917-9851,

,

Iryna G.Puhachova – Cand. Sci. (Agriculturе), Associate Professor of the Department of the Agricultural Biotechnology, Ecology and Radiology, Belarusian State Agricultural Academy, SPIN-code: 3875-8999,

,

Mihail M. Dobrodkin – Cand. Sci. (Agriculturе), Associate Professor, Belarusian State Agricultural Academy,

SPIN-code: 2238-2173,

,

Alexander V. Kilchevsky – Academician of the National Academy of Sciences of Belarus, Dr. Sci. (Biology), Professor, Scientific Director of the Laboratory of Environmental Genetics and Biotechnology, Institute of Genetics and Cytology of National Academy of Science of Belarus, SPIN-code: 2496-4294,

,

ISSN 2618-7132 (Online) Овощи России №1 2025      [ 13 ] Vegetable crops of Russia №1 2025 ISSN 2072-9146 (Print)