Использование мужской стерильности типа OGURA в селекции редиса на гетерозис

В каталогах ведущих зарубежных семеноводческих фирм Японии, Франции, Нидерландов и в других странах (Beijo Zaden, Rick Zwaan, Roijl Sluis) предлагаются F₁ гибриды редиса, производство которых занимает 90100% площадей. В нашей стране зарубежными фирмами предлагаются семена F₁ гибридов редиса, созданных на основе мужской стерильности (Донар, Тарзан, Ровер и др.). По данным на 2011 год в Государственный реестр селекционных достижений включено 24 гибрида F₁ редиса, в основном иностранной селекции (Нидерланды, Франция и др.).

Использование самонесовместимости в селекции культурных растений семейства капустных было начато в США (Pearson O.H., 1932), затем в Японии, Болгарии, Великобритании, Нидерландах и в нашей стране. В 70-е годы во ВНИИССОК В.Я. Кравчуком выделены самонесовмести-мые растения среди сортов редиса Розово-красный с белым кончиком и Тепличный Грибовский путем анализа за- вязываемости семян от автогамного опыления цветков. Выделены и отобраны гомозиготные растения по аллелям самонесовместимости, в результате оценки их на комбинационную способность отобрано 6 самонесовместимых линий, гибриды с которыми превосходили исходные сорта по массе корнеплода на 22-65% (Кононков П.Ф., Кравчук В.Я., Мохов А.И., Рабунец Н.А., 1977).

Спорофитная система самонесовместимости для достижения высокой гомозиготности и получения изогенных линий требует ручного опыления бутонов. Это трудоемкий процесс, что и приводит к сокращению числа родительских компонентов (Монахос, Барашева, 1999).

Наиболее полно преимущества генетического подхода проявляются при использовании цитоплазматической мужской стерильности. Среди растительного разнообразия видов Brassica L. форма с ядерно-цитоплазматической мужской стерильностью впервые обнаружена Ogura (1968) у неидентифицированного сорта японского подвида редьки – дайкона. В семидесятых годах Боннет (Bonnet A., 1975) интродуцировал форму мужскостерильного дайкона во Францию и передал мужскую стерильность редису. Это позволило ему создать линии редиса – закрепители стерильности и уже в 1977 году в официальном каталоге Франции был зарегистрирован первый F1 гибрид редиса, созданный на основе этого типа стерильности.

Во ВНИИССОК ведутся исследования по созданию гибридов с 1990 года. Среди обширной коллекции сортоо-бразцов дайкона, интродуцированнной в 1988 году в Россию Буниным М.С., выделена форма мужскистерильного дайкона. Гибридологический анализ показал, что андро-стерильность у него контролируется взаимодействием между рецессивным ядерным геном в гомозиготном состоянии msms и стерильной цитоплазмой (S), то есть соответствует Ogu-ЦМС (Бунин М.С., 1992). Большой научный и практический интерес для гетерозисной селекции различных видов растений семейства Brassicaceae L. имеет использование этой формы дайкона в качестве донора Ogu-ЦМС.

В лаборатории селекции и семеноводства столовых корнеплодов ВНИИССОК проводятся исследования по передаче ЦМС-ogu от дайкона редису. Путем скрещивания фертильных линий с линией ЦМС-ogu установлено, что во многих гибридных поколениях наблюдается 100% фертильность. Предположительно, большинство сортов и селекционных форм редиса, участвовавших в скрещиваниях, имеют доминантный по фертильности генотип и использованные опылители подходят для выделения из них закрепителя стерильности. Выявлены особенности наследования и характер проявления основных морфобиологических признаков в гибридном потомстве F1 при скрещивании андростерильной формы дайкона с сорто-популяциями редиса и дайкона (Бунин М.С., Кириллова А.Б., 1997; Даньков А.М., 2001; Заячковская Т.В., 2005; Заячковская Т.В., Федорова М.И. и др., 2005).

На Селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева созданы пары МС-линия-закрепитель ядерно-цитоплазматической стерильности, впоследствии созданы и внесены в Госре-естр первые отечественные гибриды дайкона Император и Фламинго, созданные на основе ogu-ЦМС. Также созданы стерильные линии лобы и линии закрепителя стерильности на основе гибридизации выделенного из коллекции селекционной станции стерильного образца дайкона с отборами из лобы. Во ВНИИ овощеводства также начата работа по оценке и созданию исходного материала для гетерозисной селекции редиса (Зубик И.Н., 2005; Миронов А.А., 2010; Янаева Д.А., 2011).

Материалы и методы

Исследования проводили в условиях защищенного грунта. Материал для исследований – образцы отечественной и зарубежной селекции: гибридные популяции и сортопопуляции редиса Королева Марго, Фея, Дуро, Красный великан, Французский завтрак, Родос, Вариант, Моховский; перспективные сортообразцы редиса – 42/03 (сортотип розово красный с белым кончиком), 43/03 (сортотип фиолетовый), 45/03 (сортотип красный), F1 Тарзан; сортопопуляции дайкона.

Маточные корнеплоды выращивали по общепринятой методике. Для скрещиваний отбирали хорошо развитые семенные растения, которые изолировали в фазу бутонизации индивидуальными изоляторами. Опыление проводили вручную. Гибридные потомства от скрещивания ms x mf анализировали по признаку стерильности в период массового цветения, а также по хозяйственноценным параметрам. Стерильность определяли числом стерильных растений от их общего количества в процентах. Методы работы – инбридинг, беккроссирова-ние, сибсовые скрещивания и отбор. Длину частей цветка стерильных и фертильных растений на разных стадиях развития бутонов измеряли с использованием линейки на бинокулярной лупе «OPTON M 35 W». Цитологический анализ проводился на временных ацетокар-

Рис. 1. Развитие микроспор цветка редиса с ЦМС- Ogura.

А – тетрады, Б – не распавшиеся тетрады, В – стерильная пыльца.

Рис. 2. Развитие микроспор цветка дайкона с ЦМС-Ogura, (х90). А – тетрада, Б – распад тетрад, В – стерильная пыльца.

миновых препаратах по методике Паушевой, а для окрашивания пыльников использовали дифференциальный краситель (Паушева, 1988; Данвелл, 1989).

Создание ms-линий редиса проводили с использованием генисточника андростерильности формой дайкона с ЦМС-Ogura – MS Gensuke. Получены беккроссиро-ванные и инбредные потомства на основе гибридов F1 мс х Моховский, мс х Французский завтрак, мс х Вариант, мс х 43/03, мс х Красный Великан – 203/07-209/07, 216/07-223/07, 213/07-215/07, 314/07, 200/07-212/07 и 313/07.

Всего изучено 98 беккроссированных потомств (ВС1 – ВС3), полученных на основе исходных частично стерильных 14-ти популяций F1, 334 инбредных потомств (J1 – J5), 69 гибридных комбинаций.

Результаты и обсуждение

Несомненную актуальность представляет собой иссле- дование Ogu-ЦМС с точки зрения развития пыльцы цветков у фертильных растений и ЦМС-форм, что имеет научный приоритет. В связи с этим для более полного представления о данном типе стерильности совместно с лабораторией биотехнологии ВНИИССОК (Шмыковой Н.А.) проведено сравнительное изучение морфологических особенностей цветка и развития пыльника стерильных и фертильных цветков растений.

Путем цитологического анализа установлены особенности нарушения развития пыльника стерильного дайкона и редиса.

Они становятся заметными, как правило, на стадии тетрад или ранних одноядерных микроспор (рис.1, 2). В пыльниках бутонов длиной 2,5 мм в одноядерных микроспорах не происходит утолщение оболочки. Микроспоры слипаются, образуя конгломераты, которые не контактируют со стенками пыльника в отличие от микроспор фертильных растений, которые не слипаются, а равномерно распреде- ляются по периметру стенки пыльцевого гнезда (рис. 3, 4). В итоге в бутонах дайкона размером 3 мм пыльца уже стерильная. Следствием нарушения процессов микроспорогенеза и развития соматических тканей пыльника у андростерильной формы дайкона является уменьшение размера пыльника, которое начинается после распада тетрад в бутонах длиной 2 мм.

На графике представлена динамика развития основных частей цветка дай-

кона в процессе онтогенеза. Анализ данных показал, что уже в бутонах длиной 2 мм пыльник фертильных растений дайкона длиннее пыльника стерильных растений на 0,2 мм (рис. 5). Превышение в длине пестика над тычинкой наблюдается при всех исследуемых размерах бутона как фертильных, так и стерильных цветков.

В этот период растения с ЦМС можно определить визуально: внутри бутона длиной 5мм хорошо видны темножелтые или коричневые, слипшиеся пыльники дайкона и редиса с ЦМС-Ogura (рис 6).

Рис. 4. Поперечный срез пыльников стерильного цветка дайкона (увеличение 6,4).

А - на стадии развития одноядерных микроспор, Б - на стадии развития зрелой пыльцы.

Рис.3. Поперечный срез пыльников фертильного цветка дайкона (увеличение 6,4).

А - на стадии развития одноядерных микроспор, Б - на стадии развития зрелой пыльцы.

Длинабутона, мм

Рис. 5. Изменение длины частей цветка стерильных и фертильных растений дайкона в онтогенезе.

• - ♦— тычинка МС

• - ■— пестик МС

• - *— пыльник МС

• ■ е— тычинка МФ

в— пестик МФ

• - 6— пыльник МФ

  
  
  
  

  Рис. 6. Пыльники и пестик фертильного и стерильного цветка растений: А - редиса, Б - дайкона, длина бутона 5мм (*90).

  
  

Таким образом, на самых ранних стадиях развития цветка различия в развитии пестика и тычинки как стерильных, так и фертильных растений незначительны. Только в самых крупных бутонах длиной 6,5 мм непосредственно перед раскрытием цветка фиксируются морфологические нарушения в развитии тычинки стерильных цветков, проявляющиеся в увеличивающейся разнице ее длины по сравнению с длиной пестика.

Изучение размеров частей раскрытых фертильных и стерильных цветков показало, что внешнее и внутреннее строение обоих типов цветка одинаковое. Бледно-розовые лепестки цветка изучаемой формы дайкона с ЦМС по окраске практически не отличались от окраски лепестков цветка фертильного дайкона (рис. 7).

Наблюдения в период массового цветения растений дайкона и редиса также показали, что, цветки растений мужскистерильной формы дайкона отличаются от фертильных цветков величиной основных частей. Цветки муж-скистерильной формы дайкона меньше, чем цветки фертильных растений. Размер цветка фертильных растений дайкона и редиса варьировал в пределах 20,1-21,6 мм, 17,8-19,9 мм, соответственно. Как и размеры цветка, так и его части – тычинка, пестик, пыльник и цветоножка – у стерильных растений дайкона меньше, чем соответствующие части цветков фертильных растений. Визуально, наиболее заметен выступающий над тычинками пестик, что является маркерным признаком полностью стерильных растений дайкона (рис. 7).

Отставание пыльников в развитии в процессе онтогенеза цветка приводит к тому, что в раскрытых цветках темно-жел-

Рис. 7. Соотношение частей цветка фертильных и стерильных растений дайкона. А - цветок фертильного растения, Б - цветок стерильного растения

тые или коричневые, сморщенные, без высыпающейся пыльцы пыльники стерильного дайкона короче на 0,56мм, чем у хорошо сформированных пыльников фертильных растений дайкона, которые имеют ярко-желтую окраску и легко растрескиваются. Полученные данные являются основой для определения стерильности типа ЦМС-Ogura на морфологическом и цитологическом уровнях в селекционной работе с использованием этого типа стерильности (Бунин М.С., Шмы-кова Н.А., Заячковская Т.В., 2004).

Гибридное потомство от скрещивания стерильной формы и фертильных растений анализировали по признаку ms и группе хозяйственно ценных параметров с целью отбора перспективных гибридных комбинаций для селекции на гетерозис. Гибридные комбинации получены с участием в качестве отцовских компонентов растений сортопопуляций редиса и дайкона. В результате анализа гибридного потомства по признаку стерильности в 9 гибридных популяциях из 14 обнаружены растения с признаками мужской стерильности.

Количество растений с признаками стерильности в полученных гибридных комбинациях 10 – 71%; доля цветков с признаками стерильности – 65-100%.

Таким образом, в результате анализа признака стерильности гибридного потомства, полученного на основе сте- рильной формы дайкона, были выделены перспективные сортопопуляции редиса Дуро, Французский завтрак и №42/03, Моховский, Вариант. Они использованы как перспективные источники для будущих линий – закрепителей признака стерильности.

Гибриды F1 различались между собой по ряду морфологических признаков листовой розетки и корнеплода (рис. 8). Форма листовой розетки варьировала в наибольшей степени среди всех качественных признаков гибридов F1 (Cv=39,66%). Также как и у материнской формы дайкона, гибриды характеризовались крупной листовой розеткой (30,0-40,2 см), рассеченными узколировидными листьями, наличием опушения на черешках листьев (рис. 8). Гибриды, полученные от скрещивания с разными формами дайкона, имели больше листьев в розетке (9-11 шт.), чем гибриды, полученные от скрещивания дайкона и редиса (7-9 шт.). Рассеченность их достигала 12-13 долей, тогда как у последних – 6-9 долей. Варьирование по признакам длины, ширины и формы листовой пластинки было незначительным (Cv=13,58%, 13,29% и 10,29%, соответственно). Длина листовой пластинки колебалась от 23 до 35 см., что значительно большее листовой пластинки редиса (на 20-30%).

Рис. 8. Гибриды F1 с редисом : 2 - Фея, 7 - Королева Марго, 9 - №43/03, 11 - Моховский, полученные на основе стерильной формы дайкона.

гибридное потомство, исходная популяция

Рис. 9. Проявление стерильности в инбредных потомствах и гибридных комбинациях

При скрещивании длиннокорнеплодного дайкона (масса 122 г) с корнеплодами редиса (округлая форма, масса 15-20 г) у гибридов F1 преобладали корнеплоды промежуточной формы, которые значительно превосходили по массе отцовские родительские компоненты. Отмечена значительная изменчивость формы и индекса формы корнеплодов гибридов F1 (Cv=51,32% и Cv=55,15%, соответственно). В связи с этим гибриды были сгруппированы по форме: I – округло-овальные корнеплоды с массой 130-163 г, II – овальные с массой 100-225 г, III – цилиндрические с массой 57-117 г.

Гибриды, где в качестве отцовских компонентов использовались сортопопуляции редиса Вариант, Французский Завтрак и Фея характеризовались наибольшей массой корнеплода 152-225 г. Варьирование признака длины и диаметра корнеплода гибридов было наименьшим среди количественных признаков и составляло Cv=21,56% и Cv=26,06%, соответственно.

Структура наружной окраски корнеплодов гибридов F1 в большинстве случаев неоднородная как в пределах корнеплода (Cv=25,35%), так и в пределах всего потомства (Cv=44,38%). Преобладающая на- ружная окраска изменялась от белой (у гибридов с дайконами) до фиолетовой (у гибридов с редисами); степень интенсивности окраски – от головки к основанию корнеплода.

Масса растений гибридов также варьировала (Cv=29,49%) и составляла 103-305 г, при массе отцовских растений редиса – 18-38 г. При этом доля листовой розетки большинства гибридов уменьшилась в общей массе растения по сравнению с обеими родительскими формами.

Гибридные комбинации с округло-овальной и овальной формой корнеплода МС х Фея, МС х Мохов-ский, МС х Французский Завтрак и МС х Вариант характеризуются преобладающей долей корнеплода в массе растения и высокой продуктивностью по сравнению с родительскими компонентами и являются наиболее перспективными для создания закрепителя стерильности, а также исходных линий с высокими хозяйственно-ценными показателями, обеспечивающими проявление гетерозисного эффекта в гибридных комбинациях с андростерильной формой дайкона.

Выделенные исходные гибридные популяции F1 характеризовались степенью стерильности в пределах 25-

1. Перспективный исходный линейный материал для гетерозисной селекции редиса (ms-100%)

Исходная популяция	Гибридное потомство
Моховский	457/11 (127-2х127-3)
	474-А/11(162-2мф)
	477/11 (163-2мф)
	481/11 (163-6мф)
	508/11 (320-1мсх320-2мф)
	512/11 (332-1мсх331-1мф)
Красный великан	569/11 (362-3х363-4)
№222/07	560/11 (356/11мсх360-1мф)
	631/11 (238-1мс х 238-2мф)
Вариант	619/11 364/10 (145-1/08)
	619-А /11 364/10 (364-2мсх366-2мф)
	620/11 (366-2мф)
	623/11 (366-3мсх366-4мф)
№43/03	434/11 (92-1мс х 92-2мф)

50%. В первом поколении беккросса ВС1 выделено шесть потомств со степенью стерильности 33-100%; в 26 изученных потомствах ВС2 стерильность варьировала от 10 до 100%, в трех потомствах все растения оказались стерильными. Однако степень наследования стерильности в результате третьего беккроссирования в этих трех потомствах составила 30-63%. В результате дальнейшего беккроссирования получено 52 потомства ВС3 со степенью стерильности 19-100%, два – со степенью стерильности 3-6%, а также одно полностью фертильное потомство. Анализ скрещиваний, проведенных на основе сортопопуляций редиса Моховский, Вариант, 43/03, Красный великан, позволил выделить пять ин-бредных потомств со степенью стерильности 83-100 % и 9 гибридных комбинаций ms x mf – со стерильностью 71-100% (рис. 9). Выделено 14 потомств, гибридных комбинаций ms x mf и линий со 100%-ной стерильностью. В трех из них №№ 619, 619А, 569 стерильность сохраняется в последующих потомствах и закреплена №№ 363-4, 366-2 (табл. 1). Таким образом, созданы стерильные линии и закрепители как перспективные для создания гетерозисных гибридов редиса F1.

Заключение

Сравнительное изучение развития пыльников цветков стерильных и фертильных растений, особенно процесса развития микроспор in vivo, необходимо для раскрытия причин нарушения процессов микроспорогенеза в пыльниках растений с ЦМС – Ogura. В пыльниках андростерильной формы дайкона нарушения в развитии микроспор проявляются на стадии тетрад или ранних одноядерных микроспор. Следствием нарушения является уменьшение размера пыльника цветков стерильных растений, которые начинаются после распада тетрад в бутонах длиной 2 мм. В самых крупных бутонах длиной 6,5 мм непосредственно перед раскрытием цветка фиксируется отставание в развитии тычинки от пестика. Полностью раскрытые цветки стерильных растений имеют меньший размер основных частей цветков, деформированные пыльники и отлича- ются от фертильных наличием выступающего над тычинками пестика, что является маркерным признаком для данного типа стерильности.

Изучение изменчивости основных морфобиологических признаков гибридов F1 на основе ЦМС-Ogura позволило провести оценку используемых в качестве опылителей сортопопуляций редиса и дайкона различных сортотипов, как потенциальных родоначальников линий с высокими показателями, обеспечивающи- ми проявление гетерозисного эффекта по большинству морфобиологических признаков. Гибриды F1 характеризовались крупной листовой розеткой, рассеченными узколировидными листьями, наличием опушения на черешках листьев, как у материнской формы дайкона. Наследование массы корнеплода происходит по промежуточному типу. ЦМС-Ogu передавалась большинству гибридных потомств со степенью стерильности 3-70%.