Использование термочувствительных липосом и локальной гипертермии для доставки доксорубицина в опухоль

Актуальность. Эффективность противоопухолевых препаратов ограничена их высокой общей токсичностью и метаболической неустойчивостью в организме. Так, дозозависимая кардиотоксичность антрациклинового антибиотика доксорубицина (Докс) – основной фактор, препятствующий его широкому применению в онкологии. Использование липосом для целенаправленной доставки цитостатиков является одним из перспективных направлений в химиотерапии злокачественных новообразований. Липосомы представляют собой везикулы, состоящие из одного или нескольких фосфолипидных бислоев, разделенных водной фазой. Идея термочувствительных липосом заключается в их способности высвобождать лекарственный препарат в опухоли в ответ на воздействие локальной гипертермии (40-43°C). Терапевтический эффект, возникающий при совместном применении термолипосом (ТЛ) и локальной гипертермии (ГТ), обусловлен несколькими причинами: ГТ увеличивает проникновение ТЛ из кровеносных сосудов в опухоль, поэтому ТЛ могут избирательно накапливаться в прогреваемой опухоли; повышенная температура способ- ствует триггерному высвобождению препарата из ТЛ; ГТ оказывает прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки.

Цель исследования. Получение термочувствительной липосомальной формы доксорубицина (Докс-ТЛ), изучение противоопухолевой активности Докс-ТЛ на клетках in vitro и перевивных опухолях мышей in vivo в комбинации с ГТ.

Материал и методы. ТЛ получали методом обращения фаз из 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC) фирмы Lipoid (Германия), пегилированного 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DSPE-PEG-2000) и холестерина (Avanti Polar Lipids, Inc., США) в молярном соотношении 9:1:0,02:0,2. Для предотвращения окисления липидов добавляли 2 моль% α-токоферола ацетата. ТЛ экструдировали через поликарбонатные мембраны Whatman с размером пор 200 нм при 50°C с помощью мини-экструдера Avanti Mini-Extruder (США). Докс загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония при 50°C в течение 1 ч. Весовое соотношение препарат:липиды – 0,13:1. Для стабилизации Докс-ТЛ проводили их сублимационную сушку с использованием в качестве криопротектора 4% раствора сахарозы. Диаметр везикул измеряли на приборе Nicomp-380 Submicron Particle Sizer (США). Докс-ТЛ очищали от невключившегося препарата методом гель-фильтрации на хроматографической колонке C10/20, заполненной сефадексом G-50 (Amersham Biosciences, Швеция). Эффективность действия Докс-ТЛ оценивали по сравнению со свободным Докс. In vitro Докс-ТЛ и свободный Докс вводили в суспензию клеток меланомы В-16 в дозах, соответствующих 3-15 мкг/мл Докс, а в суспензию клеток китайского хомячка V-79 – в дозе 10 мкг/мл Докс. Суспензии клеток с препаратами инкубировали в течение 1 ч при 37°C или 42,5°C. In vivo действие препаратов оценивали на меланоме В-16, привитой самкам мышей линии C57BL/6j, и карциноме Эрлиха линии ELD, привитой самкам мышей F1 в мышцу голени. Докс-ТЛ и свободный Докс вводили животным в ретроорбитальный синус в дозах 9 и 4,5 мг/кг Докс. ГТ голени с опухолью проводили в водяном ультратермостате при температуре 43°C в течение 30 мин.

Результаты. Получен препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» с диаметром везикул 170 ± 10 нм. Включение Докс в ТЛ до лиофилизации составило 87-94 %. В условиях ГТ Докс-ТЛ значительно увеличивали гибель как клеток меланомы B-16, так и клеток китайского хомячка V-79. Время удвоения объема меланомы B-16 в группе животных, которым вводили свободный Докс в дозе 9мг/кг с последующей ГТ, составило 9 дней, а после введения Докс-ТЛ в дозах 4,5 и 9 мг/кг в комбинации с ГТ время удвоения объема опухоли увеличилось до 12 и 16 дней соответственно. В группе мышей, подвергнутых воздействию ГТ на фоне введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг, 50% выживаемость составила 34 дня, а в группе мышей, которым вводили Докс-ТЛ в дозе 4,5 мг/кг + ГТ, она составила 29 дней. Для группы животных, которым вводили свободный Докс в дозе 9 мг/кг + ГТ, 50% выживаемость составила 21 день. Наименьшую скорость роста карциномы Эрлиха линии ELD наблюдали в группе мышей, которым проводили ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ. Время удвоения объема опухоли в этой группе возросло по сравнению с контролем с 3 до 14 дней. При воздействии ГТ через 10-12 мин и через 35-40 мин после введения Докс-ТЛ торможение роста опухоли было менее выраженным. Наибольшую выживаемость также наблюдали в группе животных, которым проводили ГТ через 15-20 мин после введения Докс-ТЛ. В этой группе 100% выживаемость отмечалась в течение 38 дней, к 50-му дню от начала эксперимента в живых остались 2 мыши, в контрольной группе к этому дню погибли все животные.

Выводы. Препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» в комбинации с ГТ менее токсичен, более эффективен, чем свободный Докс, и может быть рекомендован для термохимиотерапии солидных опухолей.

Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства г. Москвы