Использование трехцветного FISH-метода окраски хромосом при анализе радиационно-индуцированных аберраций хромосом: пилотное исследование

Добровольская Е.И.; Нугис В.Ю.; Снигирева Г.П.; Козлова М.Г.; Никитина В.А.; Dobrovolskaya E.I.; Nugis V.Yu.; Snigiryova G.P.; Kozlova M.G.; Nikitina V.A.

Научные статьи \ Математика. Естественные науки \ Биологические науки в целом

Использование трехцветного FISH-метода окраски хромосом при анализе радиационно-индуцированных аберраций хромосом: пилотное исследование

Автор: Добровольская Е.И., Нугис В.Ю., Снигирева Г.П., Козлова М.Г., Никитина В.А.

Журнал: Саратовский научно-медицинский журнал @ssmj

Рубрика: Научные школы и памятные даты

Статья в выпуске: 4 т.15, 2019 года.

Бесплатный доступ

Цель: сравнить частоты радиационно-индуцированных транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода, при использовании различных наборов ДНК-зондов. Материал и методы. Материалом для цитогенетического исследования послужила венозная кровь одного здорового донора мужского пола, подвергнутая гамма-облучению in vitro в дозах 0,1-3,0 Гр. Культивирование лимфоцитов и приготовление препаратов хромосом осуществляли с помощью вариантов стандартных методик. Хромосомы окрашивали раздельно трехцветными ДНК-зондами: для 1, 4 и 12 пар и для 2, 3 и 8 пар. Результаты. Возрастание дозы вызывало увеличение частоты транслокаций при использовании обоих наборов ДНК-зондов. При применении любого из них частоты FISH-регистрируемых транслокаций во всех клетках (стабильных и нестабильных) существенно не отличались от аналогичной величины только в стабильных клетках. Сравнение частот транслокаций, выявляемых с помощью ДНК-зондов разных видов, также показало отсутствие статистически существенных различий как во всех, так и в стабильных клетках. Заключение. Использование двух выбранных наборов ДНК-зондов продемонстрировало отсутствие значимых различий между ними по наблюдаемым частотам индуцированных радиацией транслокаций хромосом.

Еще

Fish-метод, культура лимфоцитов периферической крови, облучение, транслокация

Короткий адрес: https://sciup.org/149135407

IDR: 149135407 | УДК: [57+61]:575.224.232:616-00

Use of the tricolor FISH-painting method of chromosomes for the analysis of radiation-induced chromosomal aberrations: a pilot study

Purpose: to compare the frequency of radiation-induced translocations detected by three-color FISH-method using different sets of DNA probes. Material and Methods. The material for the cytogenetic study was venous blood of one healthy male donor subjected to in vitro gamma-radiation in doses of 0.1-3.0 Gy Cultivation of lymphocytes and preparation of chromosome specimens were carried out using variants of standard techniques. Chromosomes were stained separately with three-color DNA probes: for 1, 4 and 12 pairs and for 2, 3 and 8 pairs. Results. The increase of dose produced frequency of translocations growth when using both sets of DNA probes. When using any of them, the frequencies of FISH-registered translocations in all cells (stable and unstable) did not differ significantly from the same value only in stable cells. A comparison ofthetranslocation frequencies detected using DNA probes of different species also showed absence of statistically significant differences in both all and stable cells. Conclusion. The use of two selected sets of DNA probes demonstrated absence of significant differences between them in the observed frequencies of radiation-induced chromosome translocations.

Еще

Текст научной статьи Использование трехцветного FISH-метода окраски хромосом при анализе радиационно-индуцированных аберраций хромосом: пилотное исследование

¹ Введение. Подсчет аберраций хромосом с помощью их классической окраски в культурах лимфоцитов периферической крови является общепринятым методом биологической индикации дозы в ближайшие сроки после острого внешнего облучения в дозах, вызывающих развитие острой лучевой болезни, и основан на определении частоты дицен-триков, которая имеют тенденцию к снижению с течением времени [1]. Для ретроспективной оценки дозы или ее индикации при пролонгированном/хро-ническом облучении рекомендуется использовать FISH-окрашивание хромосом [1], которое позволяет выявлять реципрокные транслокации, не представляющие механического препятствия для протекания митоза и относящиеся поэтому к стабильному (во времени) типу перестроек хромосом. Для оценки дозы по средней частоте дицентриков обычно используют кривые «доза — эффект», полученные по результатам облучения крови здоровых доноров in vitro. Аналогичным образом предложено поступать и для ретроспективной оценки дозы по частотам реципрокных транслокаций с помощью FISH-метода.

До настоящего времени основным для цитогенетической ретроспективной оценки дозы является одноцветный вариант FISH-методики с использованием комплементарных к ДНК хромосом ДНК-зондов с присоединенным каким-то одним флуорохромным красителем. При этом обычно выбирают хромосомы из групп А, В и С, так как они являются наиболее крупными в кариотипе человека. С другой стороны, исследователи, по-видимому, не хотят ограничиваться наибольшими хромосомами только из группы А, хотя в целом большинство исходит из гипотезы о зависимости вероятности вовлечения каждой данной хромосомы в перестройку только от количества содержащееся в ней ДНК. Однако было бы интересно и полезно узнать, насколько может повлиять

на чувствительность FISH-метода регистрация обменов не только между тремя выбранными FISH-окрашенными и контрокрашенными хромосомами, но и между самими этими FISH-окрашенными хромосомами.

Цель : сравнить частоты радиационно-индуцированных транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода, при использовании различных наборов ДНК-зондов.

Материал и методы. Материалом для данного первичного цитогенетического исследования послужила полученная из кубитальной вены кровь одного здорового донора мужского пола (возраст — 41 год). Радиационное воздействие производилось in vitro при комнатной температуре гамма-лучами ⁶⁰Со на терапевтической установке «Луч» в дозах 0,10; 0,15; 0,25; 0,35; 0,50; 0,75; 1,00; 1,50; 2,00 и 3,00 Гр (мощность дозы равнялась 0,5 Гр/мин). Одна проба осталась необлученной для регистрации контрольного уровня аберраций хромосом. Облученная и необлученная кровь использована для постановки в стерильных условиях 50-часовых культур лимфоцитов периферической крови в соответствии с принятой в лаборатории методикой, которая в целом аналогична подходу, представленному в рекомендациях МАГАТЭ (2011) [1]. Препараты хромосом также готовили стандартным способом. При выполнении трехцветного FISH-метода окрашивания хромосом использовали готовые наборы ДНК-зондов к парам целых хромосом № 1, 4, 12 и № 2, 3, 8 (контркраситель DAPI) фирмы MetaSystems. Следует отметить, что по суммарному относительному содержанию ДНК оба эти набора близки друг к другу. Доля ДНК в них по отношению к диплоидному набору хромосом у мужчин равняется 0,1917 и 0,1966 соответственно. При обработке и окраске препаратов хромосом руководствовались прилагаемой к набору фирменной инструкцией.

В настоящем первичном исследовании решили ограничиться сравнением выхода радиационно-ин- дуцированных транслокаций при использовании различных наборов ДНК-зондов и во всех (стабильных и неаберрантных) и нестабильных клетках, причем учитывали аберрации с участием как FISH-окрашенных, так и контрокрашенных хромосом. Для этого применен G-критерий знаков для двух связанных выборок при критическом уровне значимости, равном 0,05 (пакет статистических программ Statistica 6).

Результаты. В табл. 1 представлены результаты цитогенетического анализа культур лимфоцитов периферической крови выбранного здорового донора при использовании трехцветного FISH-окрашивания с помощью ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом. Аналогичные данные приведены в табл. 2 для ДНК-зондов к 2, 3 и 8 парам хромосом. Показаны данные для аберраций хромосом, в образовании которых участвовали FISH-окрашенные структуры.

Обсуждение. Наряду с ожидаемыми транслокациями между FISH- и контрокрашенными хромосомами и между разными FISH-окрашенными хромосомами при достаточно больших дозах (больше 1 Гр) встречались редкие и интересные находки в виде клеток с наблюдавшимся обменом дисталь-

Таблица 1

Результаты цитогенетического трехцветного FISH-анализа культур лимфоцитов периферической крови здорового донора в контроле и после гамма-облучения in vitro при использовании ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом

5	™l о ¹ о ГО О ^с о ф О О.Ц ц s ^ О со ZT ^	^	Число транслокаций		Частота транслокаций на 100 клеток		Фо ГО х ф О 1S У го	я 5 о о >s ф го \|Л	§° ^1	Ко ГО О О Ф го о 6 S 5.Ф ™ §	s!s SS5	Частота транслокаций на 100 клеток на весь геном
5	™l о ¹ о ГО О ^с о ф О О.Ц ц s ^ О со ZT ^	^	полных	неполных	все клетки	стабильные клетки	Фо ГО х ф О 1S У го	я 5 о о >s ф го \|Л	§° ^1	Ко ГО О О Ф го о 6 S 5.Ф ™ §	s!s SS5	все клетки	стабильные клетки
0	1018	1016	3	0	0,3	0,3	0	0	0	0	0,1	0,9	0,9
0,10	611	609	3	0	0,5	0,5	0	0	0	0	0,2	1,4	1,4
0,15	366	362	2	0	0,6	0,6	0	0	0,3	0	0	1,6	1,6
0,25	668	661	6	0	0,9	0,9	0	0	0,3	0	0	2,6	2,7
0,35	636	634	8	1	1,4	1,4	0	0	0,2	0	0,6	4,1	4,2
0,50	1116	1107	14,5	0	1,3	1,3	0	0	0,2	0	0,4	3,8	3,8
0,75	511	498	20	2	4,3	4,2	0	0	0,8	0	0	12,6	12,4
1,00	969	915	42	2	4,5	4,6	0	0	2,2	0	0,8	13,3	13,4
1,50	442	416	33	3	8,1	8,4	0	0,2	1,1	0	0,9	23,8	24,6
2,00	372	300	36	1	10,0	8,3	0	0	5,1	0	3,8	29,1	24,4
3,00	428	236	106,5	3	25,6	23,1	0,2	0,2	15,2	1,2	13,1	74,9	67,6

П р и м еч а н и е : при определении стабильности клеток учитывали аберрации не только по FISH-окрашенным, но и по контрокрашенным хромосомам.

Таблица 2

5	о ^хО-ГО о ^с О Ф О Q. щ ц s ^ О со zr с;	^\|§	Число транслокаций		Частота транслокаций на 100 клеток		8 g s о Го X ф О 1S У го	Я 5 о о ф го ^.^	§° ^1	Х_О ГО о О Ф го о ™ §	s!s SS5	Частота транслокаций на 100 клеток на весь геном
5	о ^хО-ГО о ^с О Ф О Q. щ ц s ^ О со zr с;	^\|§	полных	неполных	все клетки	стабильные клетки	8 g s о Го X ф О 1S У го	Я 5 о о ф го ^.^	§° ^1	Х_О ГО о О Ф го о ™ §	s!s SS5	все клетки	стабильные клетки
0	175	174	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0,10	688	686	3	0	0,4	0,4	0	0	0	0	0,2	1,2	1,2
0,15	509	508	2	0	0,4	0,2	0	0	0	0	0,4	1,1	0,6
0,25	952	948	6	0	0,6	0,6	0	0,1	0,2	0	0	1,8	1,8
0,35	1005	1000	10	0	1,0	0,9	0	0	0,1	0	0,5	2,9	2,6
0,50	1093	1075	18	1	1,7	1,8	0,1	0	0,6	0	0,6	5,0	5,1
0,75	1100	1045	24	0	2,2	2,1	0	0	0,9	0,2	0,5	6,2	6,0
1,00	438	414	16	0	3,6	3,6	0	0	0,9	0	0,5	10,5	10,4
1,50	374	335	26	0	7,0	6,9	0	0	3,5	0	1,1	19,9	19,7
2,00	546	470	62,5	3	12,0	10,7	0	0,9	5,1	0,4	3,5	34,4	30,8
3,00	565	362	146	3	26,4	21,0	1,4	0,4	12,2	0,5	10,4	75,5	60,1

ными участками между тремя хромосомами как бы «по кругу». Например, найдена метафаза, в которой часть хромосомы 3 присоединилась к хромосоме 8, часть хромосомы 8 присоединилась к контрокра-шенной хромосоме, а часть контрокрашенной хромосомы присоединилась к 3-й хромосоме. В этом случае произошло три разрыва в трех хромосомах, что может быть зарегистрировано только при рассматриваемом трехцветном FISH-методе. Возникает вопрос: сколько же образуется в этом случае транслокаций? Действительно, при одной обычной транслокации происходит два разрыва в двух хромосомах, при двух независимых транслокациях — четыре разрыва в четырех хромосомах. Поэтому мы посчитали возможным обозначить обнаруженный феномен как 1,5 транслокации, хотя в статье [2] авторы предлагают считать, что имеется 2 транслокации. В связи с тем что мы приняли решение так учитывать данные взаимосвязанные транслокации, в табл. 1 и 2 имеются парадоксальные количества транслокаций в виде целого числа с половиной: N,5 (N — целое число).

Основное предположение, лежавшее в основе предложения использовать FISH-метод для ретроспективной оценки дозы, заключалось в стабильности их частоты во времени. Однако продолжительные цитогенетические наблюдения за лицами, пострадавшими в результате реальных радиационных аварий на Чернобыльской АЭС (1986 г.) [3] и в г. Гойянии, Бразилия (1987 г.) [4], показали, что данное первоначальное положение о сохранности индуцированных частот стабильных перестроек с течением времени после облучения оказалось соответствующим действительности только до уровня доз 0,8–2 Гр, хотя на практике в подавляющем большинстве случаев при необходимости осуществления ретроспективной оценки дозы этого, по-видимому, вполне достаточно.

В целом упомянутое снижение уровней реципрокных транслокаций при реальном наблюдении за облученными лицами по сравнению с ожидаемыми по результатам исходного определения частот дицентриков в ближайшие сроки после облучения обусловлено совместным нахождением стабильных и нестабильных аберраций в одних и тех же клетках и их совместной элиминацией при репродуктивной гибели клеток из-за наличия нестабильных перестроек хромосом. Поэтому некоторые авторы предложили при ретроспективной оценке по FISH-методу подсчитывать перестройки хромосом только в стабильных клетках .

Проведенное на материале данной работы сравнение между собой частот транслокаций в стабильных и нестабильных клетках и при использовании разных наборов ДНК-зондов с использованием G-критерия знаков для двух связанных выборок позволило продемонстрировать следующее:

1. При применении любого из двух наборов ДНК-зондов частоты FISH-регистрируемых транслокаций
2. При объединении всех данных независимо от выбранного набора ДНК-проб в диапазоне всех доз радиационного воздействия от 0,1 до 3,0 Гр частоты транслокаций во всех и стабильных клетках также значимо не различались друг от друга с р =0,628. Однако при сужении диапазона доз (0,75–3,0 Гр) уровень значимости снижался до р =0,114.
3. При сравнении частот транслокаций, выявляемых с помощью разных наборов ДНК зондов для 1, 4 и 12 и для 2, 3 и 8 пар хромосом, статистически существенные различия также отсутствовали как во всех, так и в стабильных клетках: р =0,343 и 0,114 соответственно.

во всех (стабильных и нестабильных) клетках существенно не отличались от аналогичной величины только в стабильных клетках: р =0,724 и 0,131 для 1, 4 и 12 и для 2, 3 и 8 пар хромосом соответственно.

Проведенное исследование является только началом запланированной работы по построению зависимостей «доза — эффект» для частот транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода. Ясно, что для получения статистически надежных зависимостей и выявления других связанных эффектов необходимо продолжение работы с использованием облученной in vitro крови других доноров.

Заключение. Использование двух выбранных наборов ДНК-зондов продемонстрировало отсутствие значимых различий между ними по наблюдаемым частотам индуцированных радиацией транслокаций хромосом.

Список литературы Использование трехцветного FISH-метода окраски хромосом при анализе радиационно-индуцированных аберраций хромосом: пилотное исследование

Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. Vienna: IAEA, 2011; 229 p.
Suto Y, Akiyama M, Noda T, Hirai M. Construction of a cytogenetic dose - response curve for low-dose range gamma-irradiation in human peripheral blood lymphocytes using three-color FISH. Mutat Res/Genet Toxicol and Environmental Mutagenesis 2015; 794: 32-8.
Sevankaev AV, Khvostunov IK, Mikhailova GF, et al. Novel data set for retrospective biodosimetry using both conventional and FISH chromosome analysis after high accidental overexposure. Applied Radiation and Isotopes 2000; 52(5): 1149-52.
Natarajan AT, Santos SJ, Darroudi F, et al. Cesium-induced chromosome aberrations analysed by fluorescence in situ hybridization: Eight years follow up of the Goiania radiation accident victims. Mutat Res 1998; 400 (1): 299-312.