Использование трехцветного FISH-метода окраски хромосом при анализе радиационно-индуцированных аберраций хромосом: пилотное исследование

Автор: Добровольская Е.И., Нугис В.Ю., Снигирева Г.П., Козлова М.Г., Никитина В.А.

Журнал: Саратовский научно-медицинский журнал @ssmj

Статья в выпуске: 4 т.15, 2019 года.

Бесплатный доступ

Цель: сравнить частоты радиационно-индуцированных транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода, при использовании различных наборов ДНК-зондов. Материал и методы. Материалом для цитогенетического исследования послужила венозная кровь одного здорового донора мужского пола, подвергнутая гамма-облучению in vitro в дозах 0,1-3,0 Гр. Культивирование лимфоцитов и приготовление препаратов хромосом осуществляли с помощью вариантов стандартных методик. Хромосомы окрашивали раздельно трехцветными ДНК-зондами: для 1, 4 и 12 пар и для 2, 3 и 8 пар. Результаты. Возрастание дозы вызывало увеличение частоты транслокаций при использовании обоих наборов ДНК-зондов. При применении любого из них частоты FISH-регистрируемых транслокаций во всех клетках (стабильных и нестабильных) существенно не отличались от аналогичной величины только в стабильных клетках. Сравнение частот транслокаций, выявляемых с помощью ДНК-зондов разных видов, также показало отсутствие статистически существенных различий как во всех, так и в стабильных клетках. Заключение. Использование двух выбранных наборов ДНК-зондов продемонстрировало отсутствие значимых различий между ними по наблюдаемым частотам индуцированных радиацией транслокаций хромосом.

Еще

Fish-метод, культура лимфоцитов периферической крови, облучение, транслокация

Короткий адрес: https://sciup.org/149135407

IDR: 149135407

Текст научной статьи Использование трехцветного FISH-метода окраски хромосом при анализе радиационно-индуцированных аберраций хромосом: пилотное исследование

¹ Введение. Подсчет аберраций хромосом с помощью их классической окраски в культурах лимфоцитов периферической крови является общепринятым методом биологической индикации дозы в ближайшие сроки после острого внешнего облучения в дозах, вызывающих развитие острой лучевой болезни, и основан на определении частоты дицен-триков, которая имеют тенденцию к снижению с течением времени [1]. Для ретроспективной оценки дозы или ее индикации при пролонгированном/хро-ническом облучении рекомендуется использовать FISH-окрашивание хромосом [1], которое позволяет выявлять реципрокные транслокации, не представляющие механического препятствия для протекания митоза и относящиеся поэтому к стабильному (во времени) типу перестроек хромосом. Для оценки дозы по средней частоте дицентриков обычно используют кривые «доза — эффект», полученные по результатам облучения крови здоровых доноров in vitro. Аналогичным образом предложено поступать и для ретроспективной оценки дозы по частотам реципрокных транслокаций с помощью FISH-метода.

До настоящего времени основным для цитогенетической ретроспективной оценки дозы является одноцветный вариант FISH-методики с использованием комплементарных к ДНК хромосом ДНК-зондов с присоединенным каким-то одним флуорохромным красителем. При этом обычно выбирают хромосомы из групп А, В и С, так как они являются наиболее крупными в кариотипе человека. С другой стороны, исследователи, по-видимому, не хотят ограничиваться наибольшими хромосомами только из группы А, хотя в целом большинство исходит из гипотезы о зависимости вероятности вовлечения каждой данной хромосомы в перестройку только от количества содержащееся в ней ДНК. Однако было бы интересно и полезно узнать, насколько может повлиять

на чувствительность FISH-метода регистрация обменов не только между тремя выбранными FISH-окрашенными и контрокрашенными хромосомами, но и между самими этими FISH-окрашенными хромосомами.

Цель : сравнить частоты радиационно-индуцированных транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода, при использовании различных наборов ДНК-зондов.

Материал и методы. Материалом для данного первичного цитогенетического исследования послужила полученная из кубитальной вены кровь одного здорового донора мужского пола (возраст — 41 год). Радиационное воздействие производилось in vitro при комнатной температуре гамма-лучами ⁶⁰Со на терапевтической установке «Луч» в дозах 0,10; 0,15; 0,25; 0,35; 0,50; 0,75; 1,00; 1,50; 2,00 и 3,00 Гр (мощность дозы равнялась 0,5 Гр/мин). Одна проба осталась необлученной для регистрации контрольного уровня аберраций хромосом. Облученная и необлученная кровь использована для постановки в стерильных условиях 50-часовых культур лимфоцитов периферической крови в соответствии с принятой в лаборатории методикой, которая в целом аналогична подходу, представленному в рекомендациях МАГАТЭ (2011) [1]. Препараты хромосом также готовили стандартным способом. При выполнении трехцветного FISH-метода окрашивания хромосом использовали готовые наборы ДНК-зондов к парам целых хромосом № 1, 4, 12 и № 2, 3, 8 (контркраситель DAPI) фирмы MetaSystems. Следует отметить, что по суммарному относительному содержанию ДНК оба эти набора близки друг к другу. Доля ДНК в них по отношению к диплоидному набору хромосом у мужчин равняется 0,1917 и 0,1966 соответственно. При обработке и окраске препаратов хромосом руководствовались прилагаемой к набору фирменной инструкцией.

В настоящем первичном исследовании решили ограничиться сравнением выхода радиационно-ин- дуцированных транслокаций при использовании различных наборов ДНК-зондов и во всех (стабильных и неаберрантных) и нестабильных клетках, причем учитывали аберрации с участием как FISH-окрашенных, так и контрокрашенных хромосом. Для этого применен G-критерий знаков для двух связанных выборок при критическом уровне значимости, равном 0,05 (пакет статистических программ Statistica 6).

Результаты. В табл. 1 представлены результаты цитогенетического анализа культур лимфоцитов периферической крови выбранного здорового донора при использовании трехцветного FISH-окрашивания с помощью ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом. Аналогичные данные приведены в табл. 2 для ДНК-зондов к 2, 3 и 8 парам хромосом. Показаны данные для аберраций хромосом, в образовании которых участвовали FISH-окрашенные структуры.

Обсуждение. Наряду с ожидаемыми транслокациями между FISH- и контрокрашенными хромосомами и между разными FISH-окрашенными хромосомами при достаточно больших дозах (больше 1 Гр) встречались редкие и интересные находки в виде клеток с наблюдавшимся обменом дисталь-

Таблица 1

Результаты цитогенетического трехцветного FISH-анализа культур лимфоцитов периферической крови здорового донора в контроле и после гамма-облучения in vitro при использовании ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом

5	™l о ¹ о ГО О ^с о ф О О.Ц ц s ^ О со ZT ^	^	Число транслокаций		Частота транслокаций на 100 клеток		Фо ГО х ф О 1S У го	я 5 о о >s ф го \|Л	§° ^1	Ко ГО О О Ф го о 6 S 5.Ф ™ §	s!s SS5	Частота транслокаций на 100 клеток на весь геном
5	™l о ¹ о ГО О ^с о ф О О.Ц ц s ^ О со ZT ^	^	полных	неполных	все клетки	стабильные клетки	Фо ГО х ф О 1S У го	я 5 о о >s ф го \|Л	§° ^1	Ко ГО О О Ф го о 6 S 5.Ф ™ §	s!s SS5	все клетки	стабильные клетки
0	1018	1016	3	0	0,3	0,3	0	0	0	0	0,1	0,9	0,9
0,10	611	609	3	0	0,5	0,5	0	0	0	0	0,2	1,4	1,4
0,15	366	362	2	0	0,6	0,6	0	0	0,3	0	0	1,6	1,6
0,25	668	661	6	0	0,9	0,9	0	0	0,3	0	0	2,6	2,7
0,35	636	634	8	1	1,4	1,4	0	0	0,2	0	0,6	4,1	4,2
0,50	1116	1107	14,5	0	1,3	1,3	0	0	0,2	0	0,4	3,8	3,8
0,75	511	498	20	2	4,3	4,2	0	0	0,8	0	0	12,6	12,4
1,00	969	915	42	2	4,5	4,6	0	0	2,2	0	0,8	13,3	13,4
1,50	442	416	33	3	8,1	8,4	0	0,2	1,1	0	0,9	23,8	24,6
2,00	372	300	36	1	10,0	8,3	0	0	5,1	0	3,8	29,1	24,4
3,00	428	236	106,5	3	25,6	23,1	0,2	0,2	15,2	1,2	13,1	74,9	67,6

П р и м еч а н и е : при определении стабильности клеток учитывали аберрации не только по FISH-окрашенным, но и по контрокрашенным хромосомам.

Таблица 2

5	о ^хО-ГО о ^с О Ф О Q. щ ц s ^ О со zr с;	^\|§	Число транслокаций		Частота транслокаций на 100 клеток		8 g s о Го X ф О 1S У го	Я 5 о о ф го ^.^	§° ^1	Х_О ГО о О Ф го о ™ §	s!s SS5	Частота транслокаций на 100 клеток на весь геном
5	о ^хО-ГО о ^с О Ф О Q. щ ц s ^ О со zr с;	^\|§	полных	неполных	все клетки	стабильные клетки	8 g s о Го X ф О 1S У го	Я 5 о о ф го ^.^	§° ^1	Х_О ГО о О Ф го о ™ §	s!s SS5	все клетки	стабильные клетки
0	175	174	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0,10	688	686	3	0	0,4	0,4	0	0	0	0	0,2	1,2	1,2
0,15	509	508	2	0	0,4	0,2	0	0	0	0	0,4	1,1	0,6
0,25	952	948	6	0	0,6	0,6	0	0,1	0,2	0	0	1,8	1,8
0,35	1005	1000	10	0	1,0	0,9	0	0	0,1	0	0,5	2,9	2,6
0,50	1093	1075	18	1	1,7	1,8	0,1	0	0,6	0	0,6	5,0	5,1
0,75	1100	1045	24	0	2,2	2,1	0	0	0,9	0,2	0,5	6,2	6,0
1,00	438	414	16	0	3,6	3,6	0	0	0,9	0	0,5	10,5	10,4
1,50	374	335	26	0	7,0	6,9	0	0	3,5	0	1,1	19,9	19,7
2,00	546	470	62,5	3	12,0	10,7	0	0,9	5,1	0,4	3,5	34,4	30,8
3,00	565	362	146	3	26,4	21,0	1,4	0,4	12,2	0,5	10,4	75,5	60,1

ными участками между тремя хромосомами как бы «по кругу». Например, найдена метафаза, в которой часть хромосомы 3 присоединилась к хромосоме 8, часть хромосомы 8 присоединилась к контрокра-шенной хромосоме, а часть контрокрашенной хромосомы присоединилась к 3-й хромосоме. В этом случае произошло три разрыва в трех хромосомах, что может быть зарегистрировано только при рассматриваемом трехцветном FISH-методе. Возникает вопрос: сколько же образуется в этом случае транслокаций? Действительно, при одной обычной транслокации происходит два разрыва в двух хромосомах, при двух независимых транслокациях — четыре разрыва в четырех хромосомах. Поэтому мы посчитали возможным обозначить обнаруженный феномен как 1,5 транслокации, хотя в статье [2] авторы предлагают считать, что имеется 2 транслокации. В связи с тем что мы приняли решение так учитывать данные взаимосвязанные транслокации, в табл. 1 и 2 имеются парадоксальные количества транслокаций в виде целого числа с половиной: N,5 (N — целое число).

Основное предположение, лежавшее в основе предложения использовать FISH-метод для ретроспективной оценки дозы, заключалось в стабильности их частоты во времени. Однако продолжительные цитогенетические наблюдения за лицами, пострадавшими в результате реальных радиационных аварий на Чернобыльской АЭС (1986 г.) [3] и в г. Гойянии, Бразилия (1987 г.) [4], показали, что данное первоначальное положение о сохранности индуцированных частот стабильных перестроек с течением времени после облучения оказалось соответствующим действительности только до уровня доз 0,8–2 Гр, хотя на практике в подавляющем большинстве случаев при необходимости осуществления ретроспективной оценки дозы этого, по-видимому, вполне достаточно.

В целом упомянутое снижение уровней реципрокных транслокаций при реальном наблюдении за облученными лицами по сравнению с ожидаемыми по результатам исходного определения частот дицентриков в ближайшие сроки после облучения обусловлено совместным нахождением стабильных и нестабильных аберраций в одних и тех же клетках и их совместной элиминацией при репродуктивной гибели клеток из-за наличия нестабильных перестроек хромосом. Поэтому некоторые авторы предложили при ретроспективной оценке по FISH-методу подсчитывать перестройки хромосом только в стабильных клетках .

Проведенное на материале данной работы сравнение между собой частот транслокаций в стабильных и нестабильных клетках и при использовании разных наборов ДНК-зондов с использованием G-критерия знаков для двух связанных выборок позволило продемонстрировать следующее:

1. При применении любого из двух наборов ДНК-зондов частоты FISH-регистрируемых транслокаций
2. При объединении всех данных независимо от выбранного набора ДНК-проб в диапазоне всех доз радиационного воздействия от 0,1 до 3,0 Гр частоты транслокаций во всех и стабильных клетках также значимо не различались друг от друга с р =0,628. Однако при сужении диапазона доз (0,75–3,0 Гр) уровень значимости снижался до р =0,114.
3. При сравнении частот транслокаций, выявляемых с помощью разных наборов ДНК зондов для 1, 4 и 12 и для 2, 3 и 8 пар хромосом, статистически существенные различия также отсутствовали как во всех, так и в стабильных клетках: р =0,343 и 0,114 соответственно.

во всех (стабильных и нестабильных) клетках существенно не отличались от аналогичной величины только в стабильных клетках: р =0,724 и 0,131 для 1, 4 и 12 и для 2, 3 и 8 пар хромосом соответственно.

Проведенное исследование является только началом запланированной работы по построению зависимостей «доза — эффект» для частот транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода. Ясно, что для получения статистически надежных зависимостей и выявления других связанных эффектов необходимо продолжение работы с использованием облученной in vitro крови других доноров.

Заключение. Использование двух выбранных наборов ДНК-зондов продемонстрировало отсутствие значимых различий между ними по наблюдаемым частотам индуцированных радиацией транслокаций хромосом.

Список литературы Использование трехцветного FISH-метода окраски хромосом при анализе радиационно-индуцированных аберраций хромосом: пилотное исследование

Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. Vienna: IAEA, 2011; 229 p.
Suto Y, Akiyama M, Noda T, Hirai M. Construction of a cytogenetic dose - response curve for low-dose range gamma-irradiation in human peripheral blood lymphocytes using three-color FISH. Mutat Res/Genet Toxicol and Environmental Mutagenesis 2015; 794: 32-8.
Sevankaev AV, Khvostunov IK, Mikhailova GF, et al. Novel data set for retrospective biodosimetry using both conventional and FISH chromosome analysis after high accidental overexposure. Applied Radiation and Isotopes 2000; 52(5): 1149-52.
Natarajan AT, Santos SJ, Darroudi F, et al. Cesium-induced chromosome aberrations analysed by fluorescence in situ hybridization: Eight years follow up of the Goiania radiation accident victims. Mutat Res 1998; 400 (1): 299-312.

Статья научная