Исследование активности глутатионредуктазы в коре головного мозга, стволе мозга и мозжечке облучённых крыс

Радиация является неотъемлемым фактором среды обитания человека, но сравнительно большие дозы радиации, которые в обычных условиях жизни встречаются редко, могут нанести вред его здоровью. Это может иметь место при радиационных поражениях, связанных, прежде всего, с аварийными ситуациями на промышленных объектах, использующих радиационные технологии, а также с возросшей террористической угрозой, в том числе и радиационной. Всё более очевидна патогенетическая связь облучения организма с канцерогенезом, старением и некоторыми генетическими нарушениями [1-4].

Основную роль в развитии и исходе лучевых повреждений отводят критическим системам и пусковым радиочувствительным процессам, нарушения которых влияют на метаболизм органов и тканей. Глубокие изменения критической системы вызывают в дальнейшем кризисное состояние организма и его гибель [5-7]. При этом весьма показательными в плане раскрытия механизмов развития синдрома пероксидации при лучевых поражениях являются исследования состояния глутатионовой антиоксидантной системы организма [8, 9]. Глутатион (трипептид гамма-глутамилцистеинилглицина) выполняет в клетке антиоксидантную функцию, защищая её от токсичных свободных радикалов. Он способен восстанавливать дисульфидные связи между остатками цистеина, при этом восстановленная форма глутатиона превращается в окисленную.

Соотношение этих форм показывает уровень окислительного стресса в клетке. Восстанавливается окисленный глутатион под действием глутатионредуктазы (НАДФН (Н+)-зависимой) [10].

Цель работы – исследование активности глутатионредуктазы, фермента, сопряжённого с важнейшим антиоксидантом глутатионом, в различных структурно-функциональных отделах головного мозга облучённых крыс.

Материалы и методы

Опыты проводили на 72 половозрелых беспородных белых крысах-самцах, массой 170-190 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария на полноценном пищевом рационе, в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, 8-е издание [11]. Крыс подвергали однократному общему облучению у -лучами (60Со) в дозе 6 Гр, мощность дозы 0,48 Гр/мин, утром, на телегамматерапевтической установке «Агат-С»; расстояние «источник-поверхность» 50 см; поле 9 x 13 см. С целью иммобилизации при облучении животных помещали в специально изготовленные клетки из тонкого органического стекла с отверстиями для доступа воздуха.

Опыты проводились через 30 мин, 1, 3, 12 ч, 1, 3 и 7 сут после радиационного воздействия. Крыс забивали под наркозом, используя калипсол. Объектом для исследований служили отделы головного мозга: кора, стволовая часть и мозжечок. Головной мозг промывали охлаждённым физиологическим раствором, максимально освобождали от сосудов, сосудистых сплетений и оболочек, снова промывали в охлаждённом физиологическом растворе. Состригали кору, отделяли стволовую часть и мозжечок. Все операции по разделению отделов мозга проводили при температуре 0 ° С. Затем ткани мозга взвешивали на торсионных весах, измельчали охлаждёнными ножницами и помещали в гомогенизатор с тефлоновым пестиком. Скорость вращения пестика составляла 800-900 об/мин, время измельчения 25-30 с. Гомогенизирование тканей мозга проводили в среде выделения, состоящей из 0,145 М раствора KCI, содержащего 3,3 мМ КНСО3 при рН 7,4. Активность глутатионредуктазы определяли методом, описанным А.М. Герасимовым и соавт.; активность фермента выражали в нмоль/мин НАДФН на 1 г ткани [12]. Определение активности глутатионредуктазы основано на изменении скорости окисления НАДФН, измеренной на спектрофотометре при длине волны 340 нм.

Полученные данные обрабатывали общепринятыми статистическими методами [13] с использованием компьютерной программы «StatistikaV.5.5A». Численные данные представлены через среднее значение ± стандартное отклонение. Для межгруппового сравнения использован t-критерий Стьюдента. Уровень статистической значимости различий принят равным 95%. Отклонения считали статистически значимыми при значении p<0,05.

Результаты и обсуждение

Воздействие радиации в дозе 6 Гр приводит к развитию острой лучевой болезни средней тяжести и является для крыс ЛД 50/30. В результате проведённых исследований установлено, что ионизирующая радиация вызывает существенные изменения активности глутатионредук-тазы, восстанавливающей глутатион; причём эти изменения носят фазный характер в зависимости от времени, прошедшего после радиационного воздействия. Направленность этих изменений и их глубина также определяются временем, прошедшим после действия радиации (табл. 1).

Таблица 1

Активность глутатионредуктазы в различных отделах головного мозга крыс после Y-облучения в дозе 6 Гр (М±т; n=8)

Примечание: * р<0,05 – значимость различий по отношению к контролю.

Через 1 ч после облучения активность глутатионредуктазы в митохондриях и цитоплазме исследуемых отделов головного мозга значительно усиливается, превышая уровень контрольных показателей более чем на 40-60%. Спустя 3 ч после облучения имеет место заметное снижение ферментативной активности по сравнению с предыдущим сроком исследования, однако, она не достигает уровня контрольных значений. Через 12 ч после радиационного воздействия в митохондриях и цитоплазме коры головного мозга и стволовой части активность глутатионредук-тазы вновь снижается, а в субклеточных фракциях мозжечка в этот же период ферментативная активность приближается к контролю. К концу первых суток после радиационного воздействия активность глутатионредуктазы как в митохондриях, так и в цитоплазме всех исследуемых структурно-функциональных отделов головного мозга остаётся на уровне показателей контрольной группы животных. На 3-и сут после облучения происходит повышение глутатионредуктазной активности во всех отделах головного мозга экспериментальных крыс, наиболее выраженное в цитоплазме коры головного мозга. Вместе с тем, спустя 7 сут после воздействия радиации активность глутатионредуктазы в субклеточных фракциях исследуемых отделов головного мозга резко снижается, причём особенно выраженное нарушение ферментативной активности обнаруживается в митохондриях и цитоплазме коры головного мозга; в сравнительно меньшей степени эти изменения характерны для субклеточных фракций стволовой части головного мозга и мозжечка.

Как было установлено ранее, воздействие радиации способствует снижению содержания глутатиона в различных отделах головного мозга животных при модельных условиях эксперимента [14-16]. Следует при этом отметить, что в большинстве случаев изменения активности глу-татионредуктазы коррелируют с изменениями содержания глутатиона в соответствующих отделах головного мозга в динамике лучевого поражения. Так, в частности, к исходу первых суток содержание глутатиона в отделах головного мозга облучённых крыс возрастает в зависимости от исследуемого отдела мозга на 29-65%, причём, максимальное содержание его в это время обнаружено в стволовой части, а минимальное – в мозжечке. Начиная с 3-х сут после облучения содержание глутатиона в исследуемых отделах головного мозга неуклонно снижается, достигая минимальных значений на 7-е сут после радиационного воздействия.

Наиболее выраженные изменения активности глутатионредуктазы в исследуемых отделах головного мозга начинаются в первые часы после облучения. В этот период имеет место заметное, возможно компенсаторное, повышение содержания восстановленного глутатиона. По всей видимости, причинами этого могут быть не только обнаруженные изменения активности глутати- онредуктазы, но также и изменения активности глутатионпероксидазы, которое было отмечено ранее в ткани мозга после радиационного воздействия [15]. Начиная с третьих суток после облучения ферментативные процессы в митохондриях исследованных тканей начинают затухать, что отражается также и на содержании восстановленного глутатиона. Эти изменения, на наш взгляд, направлены на стабилизацию процессов перекисного окисления липидов и уменьшению негативного влияния их продуктов на метаболизм.

Таким образом, анализ результатов проведённых исследований, а также данных литературы свидетельствует о том, что на 7-е сут после радиационного воздействия содержание эндогенных антиоксидантов достигает критического уровня, что ещё раз подчёркивает, что на данном этапе происходит истощение всех звеньев антиоксидантной защиты организма.

Следует отметить, что заметным изменениям после облучения подвергаются содержание НАДФ и НАДФН+Н, участвующих в функционировании глутатионредуктазы, а также нарушается взаимоотношение между этими нуклеотидами, возможно, связанное с попыткой организма компенсировать возрастающие потребности в восстановленных эквивалентах для нормальной работы всей глутатионовой антиоксидантной системы организма, и, в первую очередь, – глутати-онредуктазы [17-19].

Интенсификация процессов перекисного окисления липидов при лучевом поражении организма способствует подавлению буферной ёмкости антиоксидантной системы, инактивации антиоксидантных ферментов. Вероятно, активация реакций свободно-радикального окисления после радиационного воздействия в первые часы приводит к возрастанию интенсивности адаптационных биохимических и патофизиологических реакций, что характеризуется неадекватным напряжением всех компонентов и звеньев глутатионовой антиоксидантной системы с последующим её истощением.

Выводы

• 1.    Воздействие ионизирующей радиации в дозе 6 Гр приводит к фазным изменениям активности глутатионредуктазы, восстанавливающей окисленный глутатион, с резким снижением активности на 7-е сут после облучения.

• 2.    Ранее обнаруженные изменения содержания глутатиона в динамике развития острой лучевой болезни средней тяжести в большинстве сроков исследования коррелируют с изменениями активности глутатионредуктазы – фермента, непосредственно сопряжённого с данным антиоксидантом.