Исследование активности экстрактов семян Chenopodium album и культуральной жидкости Fusarium sambucinum против некоторых фитопатогенных грибов

Растения и микроорганизмы продуцируют множество биологически активных соединений, разнообразные функции которых служат предметом интенсивных исследований. В частности, одна из современных тенденций сельскохозяйственной науки — поиск действующих веществ для создания биофунгицидов и других биопестицидов (1-3) как альтернативы или дополнения к химическим пестицидам (4-8). Спектр перспективных с этой точки зрения соединений микробного или растительного происхождения включает антимикробные пептиды и другие вторичные метаболиты (9-11). Их наиболее доступные источники — экстракты дикорастущих (часто сорных) растений, а также культуральная жидкость (КЖ) выращенных in vitro грибов и бактерий (12-17).

Более того, сами растительные экстракты и культуральные фильтраты с пестицидной активностью могут быть использованы для обработки растений без дополнительных (иногда дорогостоящих и сложных) процедур очистки (18-21). Например, было показано, что метанольные экстракты мари белой ( Chenopodium album ) препятствуют накоплению биомассы гриба Macrophomina phaseolina при глубинном культивировании этого фитопатогена (22), а не обладающая фитотоксичностью КЖ изолята

Работы выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект ¹ 16-16-00032).

FS-94 гриба Fusarium sambucinum Fuckel эффективно ингибирует in vitro прорастание спор возбудителей септориоза колоса пшеницы и черной гнили корнеплодов моркови (16, 17).

Очевидно, что в качестве источников потенциальных биофунгицидов особый интерес для защиты растений представляет поиск экстрактов и фильтратов, способных одновременно подавлять развитие нескольких грибов, патогенных для различных сельскохозяйственных культур.

В связи с этим мы впервые исследовали активность экстрактов из семян Chenopodium album и фильтратов КЖ непатогенного Fusarium sambuci-num против шести широко распространенных фитопатогенных грибов ( Al-ternaria alternata , A. dauci , A. radicina , Bipolaris sorokiniana , Septoria tritici , Stagonospora nodorum ), причиняющих серьезный ущерб многим экономически важным сельскохозяйственным культурам.

Методика. Для приготовления растительных экстрактов 30 г семян мари белой ( C. album ) измельчали до порошкообразного состояния и экстрагировали последовательно гексаном, этилацетатом и этанолом (для каждого растворителя соотношение 1:8 масса/объем) при интенсивном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. После каждого этапа экстракции гомогенат центрифугировали при 10000 g и 4 ° С в течение 10 мин, супернатант фильтровали через бумажный фильтр и упаривали досуха в роторном испарителе. Осадок хранили при - 80 ° С и растворяли непосредственно перед экспериментами в минимальном объеме 5 % диметилсульфоксида (ДМСО).

Фильтрат культуральной жидкости (ФКЖ), полученный после глубинного культивирования изолята FS-94 F. sambucinum (16), очищали от не ассимилированных грибом компонентов питательной среды и низкомолекулярных экзометаболитов с помощью ультрафильтрационного фракционирования (23), промывая при этом концентрат ФКЖ стерильной дистиллированной водой (сдН₂О). Препараты переведенных в воду концентратов доводили сдН₂О до объема исходного ФКЖ, стерилизовали фильтрованием через мембрану с размером пор 0,22 мкм (тип GPWP, «MilliporeSigma», США), замораживали и хранили до использования при - 20 ° С.

Изоляты Alternaria alternata (Fr.) Keissl; Bipolaris sorokiniana (Sacc.), Shoemaker; Septoria tritici Desm. и Stagonospora nodorum Berk., Castellani & E.G. Germane были получены из Государственной коллекции фитопа-тогенных микроорганизмов ВНИИФ, а изоляты A. dauci (J.G. Kuhn), J.W. Groves & Skolko и A. radicina Meier, Drechsler & Eddy — из Института селекции декоративных растений в Кведлинбурге (Institute for Breeding Research on Horticultural Crops, Германия). Для приготовления суспензий споры грибов в день эксперимента смывали сдН₂О с поверхности колоний, выращенных в течение 14 сут на КГА при 25 ° С ( A. alternata , B. soro-kiniana , Stagonospora nodorum , Septoria tritici ) или на агаре с овощным соком при 22-23 ° С ( A. dauci , A. radicina ). Споры отделяли от фрагментов мицелия фильтрованием через ватный и капроновый фильтры, осаждали центрифугированием при 3000 g в течение 20 мин и суспендировали в минимальном объеме сдН₂О.

Для оценки фунгитоксичности растительных экстрактов и ФКЖ использовали метод проращивания cпор в тонком слое агара. При этом смешивали равные объемы исходной суспензии и тестируемых образцов так, чтобы плотность конечной суспензии составляла 104/мл для A. alter-nata, A. dauci, A. radicina и B. sorokiniana или 3½103/мл для Stagonospora nodorum и Septoria tritici. Суспензии инкубировали при постоянном мед- ленном перемешивании 25-30 мин при комнатной температуре, а затем наносили на покрытые 1 % водным агаром предметные стекла (200 мкл на стекло, по 3 стекла на вариант), которые помещали во влажную камеру. Споры проращивали в темноте при 22 °С в течение 16-18 (A. dauci, A. radicina, Stagonospora nodorum, Septoria tritici) или 5-6 ч (A. alternata и B. sorokiniana). В качестве контроля в опытах с ФКЖ использовали суспензию спор в сдН2О, а при анализе экстрактов C. album — в стерильном 2,5 % ДМСО. Влияние ФКЖ и экстрактов на прорастание фитопатогенов оценивали при микроскопировании, просматривая не менее 600 спор в каждом обработанном варианте и в контроле. Частоту прорастания выражали в процентах либо от числа проросших спор в контроле, либо от общего числа спор, просмотренных в контроле и опыте.

Чтобы оценить действие ФКЖ на радиальный рост колоний Stagonospora nodorum , Septoria tritici и B. sorokiniana , их выращивали в течение 14-16 сут в темноте при 25 ° С на КГА, содержавшем фильтрат (100 мкл ФКЖ/мл питательной среды). Инокулюм в виде фрагмента мицелия вносили уколом в центр чашки Петри (диаметр 9 см). Контрольные культуры выращивали в тех же условиях на средах без добавления ФКЖ. По мере роста культур измеряли диаметр колоний (2 измерения каждой колонии в 2 разных направлениях, 3 чашки на вариант) и рассчитывали средний диаметр колоний для каждого из патогенов.

Эксперименты по проращиванию спор и изучению динамики роста фитопатогенов повторяли не менее 3 раз. Статистическую обработку результатов проводили в программе STATISTICA 6.0 («SoftStat Inc.», США). Достоверность различий с контролем (р <  0,05) определяли с помощью t -теста для независимых переменных.

Результаты. Поскольку ранее нами было установлено, что ФКЖ способен ингибировать прорастание спор Stagonospora nodorum и A. radici-na (16, 17), в настоящей работе указанные фитопатогены использовали в качестве эталонных тест-объектов для контроля активности полученных фильтратов при проверке их фунгитоксичности в отношении Septoria tritici , A. dauci , A. alternata и B. sorokiniana . Эти виды — возбудители опасных заболеваний важных сельскохозяйственных культур: септориоза пшеницы ( Septoria tritici ), пятнистости листьев ячменя и корневых гнилей злаковых ( B. sorokiniana ), бурой пятнистость листьев моркови ( A. dauci ), черни колоса пшеницы, а также альтернариозов множества других растений ( A. alternata ) (24-27).

1. Сравнительная фунгицидная активность фильтрата культуральной жидкости (ФКЖ) Fusarium sambucinum в отношении возбудителей септориоза, гельмин-тоспориоза и альтернариозов

Патоген	Прорастание спор в ФКЖ, Титр ФКЖ % к контролю
Stagonospora nodorum Septoria tritici Bipolaris sorokiniana Alternaria radicina A. alternata A. dauci	0                                1:200 (р = 0,02) 0                                1:50 (р = 0,01) 98,3±1,3                         Без разведения 0                                1:5 (р = 0,03) 5,0±0,80                            1:5 (р = 0,02) 2,0±0,04                            1:5 (р = 0,04)

П р и м е ч а н и е. Приведены средние значения для 600 спор в каждом варианте и стандартная ошибка среднего (Mean±SE) и максимальные разведения ФКЖ, при которых еще наблюдалось достоверное (р = 0,05) подавление прорастания спор по сравнению с контролем.

Эксперименты показали, что ФКЖ с типичной фунгицидной активностью в отношении эталонных тест-объектов (отсутствие проросших спор в неразведенных фильтратах и ожидаемые титры 1:200 и 1:5 соответственно для Stagonospora nodorum и A. radicina) обладали аналогичной активностью против Septoria tritici, A. alternata и A. dauci, причем ингибирующее действие ФКЖ в отношении S. tritici оказалось более эффективным, хотя этот вид был в 4 раза менее чувствительным, чем другой возбудитель септориоза пшеницы — Stagonospora nodorum (табл. 1). Как и в случае с A. radicina, статистически значимое ингибирование прорастания спор A. alternata и A. dauci наблюдалось вплоть до 5-кратного разведения ФКЖ, а в исходных фильтратах прорастание подавлялось практически полностью. Гриб B. sorokiniana оказался нечувствительным к действию ФКЖ.

Отметим, что у всех исследованных фитопатогенов, в том числе у B. sorokiniana , гифы спор, которые после контакта с ФКЖ сохраняли способность к прорастанию, имели морфологические дефекты, в частности заметные утолщения, и были значительно короче, чем в контроле (рис. 1).

Рис. 1. Cпоры Bipolaris sorokiniana , проросшие в стерильной дистиллированной воде (слева) или в фильтрате культуральной жидкости Fusarium sambucinum (справа).

отклонение среднего для двух опытов (по 6 повторов на вариант в каждом).

Рис 2. Динамика роста Stagonospora nodorum (А) , Septoria tritici (Б) и Bipolaris sorokiniana (В) на картофельно-глюкозном агаре (КГА), содержащем фильтрат культуральной жидкости (ФКЖ) Fusarium sambucinum : 1 — контроль (КГА без ФКЖ), 2 — КГА с ФКЖ (100 мкг/мл). Указаны проценты ингибирования радиального роста колоний. Разные сроки начала измерений связаны с неодинаковой скоростью роста грибов. Y-погрешности показывают стандартное

Анализ динамики роста мицелия Stagonospora nodorum , Septoria tritici и B. sorokiniana в присутствии ФКЖ показал, что при культивировании на средах, содержавших фильтрат, у этих фитопатогенов происходило заметное сокращение размера колоний (рис. 2). Обнаруженный фунгистатиче-ский эффект в отношении роста Stagonospora nodorum и Septoria tritici был стабильным и лишь незначительно изменялся к концу культивирования. В отличие от этого, ингибирующее влияние ФКЖ на рост мицелия B. soro-kiniana постепенно ослабевало, однако, различия с контролем сохранялись вплоть до завершения наблюдений (см. рис. 2).

Тестирование препаратов, полученных последовательной экстракцией семян C. album гексаном, этилацетатом и этанолом, показало, что ни один из них не обладал фунгитоксичностью в отношении Stagonospora no-dorum , Septoria tritici , A. dauci и A. radicina . В то же время некоторые из этих растительных экстрактов были способны в разной степени препятствовать прорастанию A. alternata и B. sorokiniana (рис. 3). Так, инкубация спор A. alternata в экстрактах, полученных с помощью гексана, приводила к достоверному снижению числа проросших спор (на 16 %) и снижала его в этанольных экстрактах еще на 14 %.

Рис. 3. Прорастание спор Alternaria al-ternata (А) и Bipolaris sorokiniana (Б) при инкубации с препаратами, полученными из семян мари белой (Chenopodium album) последовательной экстракцией гекcаном (а), этилацетатом (б) и этанолом (в). Экстракты растворены в 2,5 % диметилсульфоксиде (ДМСО); к — контроль (2,5 % ДМСО). Споры помещали в анализируемые экстракты. Для расчета доли проросших спор (среднее для 3 опытов) через 5-6 ч просматривали не менее 600 спор на вариант в каждом опыте. Указаны стандартные ошибки среднего.

Число спор B. sorokiniana , которые прорастали после инкубации в экстрактах гексаном и этилацетатом, сокращалось соответственно на 34 и 32 %. Таким образом, суммарное ингибирование прорастания экстрактами из C. album у этих фитопатогенов достигало 30 % ( A. alternata ) и 66 % ( B. sorokiniana ). Интересно отметить, что в отношении B. sorokiniana в двух из трех опытов по совместному применению с ФКЖ препаратов после экстракции гексаном или этилацетатом (табл. 2) фунгитоксичный эффект, согласно критерию Лимпела (Е₀< Е_rea l ), имел синергический характер (28). При этом расчетное превышение аддитивного ингибирующего действия в случае одновременного использования фильтрата и обоих последовательно полученных экстрактов в сумме составило 27-28 %.

2. Подавление прорастания спор (от общего числа, %) у Bipolaris sorokiniana при совместном применении культуральной жидкости Fusarium sambucinum и экстрактов семян Chenopodium album

ФКЖ	ЭГ	ЭЭ	ФКЖ + ЭГ		ФКЖ + ЭЭ
			E 0	E real	E 0	E real
0,8	36,3	31,9	37,1	49,6	32,7	47,2
1,3	34,7	29,6	36,0	48,5	30,9	46,7
0,6	31,0	34,2	31,4a	31,9a	34,8b	35,2b

П р и м е ч а н и е. ЭГ, ЭЭ — экстракция соответственно гексаном и этилацетатом; титр фильтрата культуральной жидкости (ФКЖ) 1:2. E 0 — ожидаемый аддитивный эффект, %, E 0 = (X + Y) - ХY/100, где Х — ФКЖ, Y — ЭГ или ЭЭ. E_real — эффект (%), полученный в эксперименте. Различия между E 0 и E_real достоверны при р = 0,05, за исключением значений, отмеченных одинаковыми латинскими буквами. При E 0 _< E_real (28) ингибирующий эффект синергичен.

Итак, наши результаты оценки влияния культуральной жидкости Fusarium sambucinum и экстрактов семян Chenopodium album на развитие шести фитопатогенных грибов in vitro позволяют сделать вывод о перспективности дальнейшего исследования состава этих продуктов с целью идентификации метаболитов, ответственных за антифунгальную активность, а также высказать предположение о возможности создания на их основе биопестицидов против возбудителей септориоза пшеницы, альтернариозов моркови и гельминтоспориоза злаковых.