Исследование аминокислотного состава кормовой добавки методом ионообменной хроматографии

Повышение потребности населения в продуктах питания является основным стимулом развития отрасли животноводства. При этом одной из тенденций является повышение продуктивности сельскохозяйственных животных за счет использования молекулярно-генетических методов селекции в сочетании с оптимизацией условий содержания, обеспечивающей наиболее полную реализацию высокого генетического потенциала животных. Повышение эффективности кормления является одним из решающих факторов в этой системе. Кормление животных в настоящее время динамично развивается благодаря поступлению новых экспериментальных данных о составе и качестве кормов и их конверсии в организме животных [1–3, 18, 19].

Аминокислоты являются одними из ключевых компонентов питания животных, как в составе белковой диеты, так и в качестве дополняющих продуктов [1, 4]. Считается, что белок не является питательным веществом. Животные нуждаются в аминокислотах, а не в белке как таковом. Качество кормового белка определяется его потенциалом для покрытия физиологических требований в отношении аминокислот на поддержание жизнедеятельности и продуктивность (рост, воспроизводство, моло-кообразование и т. д.). Потребность в кормовом белке зависит от вида животных, возраста, генотипа и пола. Отсюда следует, что существуют два важных фактора, определяющих качество белка, а) профиль аминокислот, который представляет собой соотношение незаменимых аминокислот в белке и b) их усвояемость [1]. В рационе животных возможен недостаток одной или нескольких незаменимых аминокислот, необходимых для поддержания оптимального роста и здоровья [1, 4]. Исследование аминокислотного состава кормов имеет крайне важную роль в оптимизации систем кормления, детализации и нормировании рационов сельскохозяйственных животных [5-7].

Наиболее распространенными методами количественного аминокислотного анализа являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и ионообменная хроматография с постколоночной дериватизацией проб нингидрином. Однако в практике рутинного анализа, при значительном количестве исследуемых проб метод ионообменной хроматографии имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с ВЭЖХ: более высокая точность определения, воспроизводимость результата и надежность (высокая производительность этого метода является следствием того, что большинство загрязнений быстро перемещаться по колонке и выходят из системы, прежде чем начинается разделение аминокислот), а также более простая подготовка проб (по сравнению с методами предколоночной дериватизации) [8–14].

Метод ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией проб нингидрином стандартизирован Международной организацией по стандартизации (EN ISO 13903), а также Регламентом Европейской Комиссии № 152/2009; рекомендован к использованию для анализа аминокислотного состава сырья и кормов, а также контроля полноценности аминокислотного питания животных Европейской федерацией производителей кормовых добавок и кормов для животных (FEFANA, фр. Fédération Européenne des Fabricants d’Adjuvants pour la Nutrition Animale) [1].

В данной работе рассмотрены вопросы применения ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией проб нингидрином для исследования аминокислотного состава кормов для сельскохозяйственных животных. Определено общее содержание аминокислот (кроме триптофана) в кормовой добавке на основе продуктов переработки отходов мясной промышленности, выполнена оценка полноценности добавки по содержанию незаменимых аминокислот в сравнении с референтным белком ФАО/ВОЗ и определены лимитирующие аминокислоты.

Материалы и методы

Для подготовки проб использовали кислотный гидролиз в растворе 6 М соляной кислоты, с добавлением норлейцина в качестве внутреннего стандарта. Гидролиз выполняли в термостате при 110 °С в течении 24 ч. Для определения цистина и метионина пробы окисляли 50% раствором надмуравьиной кислоты, которую предварительно готовили из муравьиной кислоты и перекиси водорода, с добавлением фенола.

Определение содержания сырого протеина выполняли методом Кьельдаля [15].

Для расчёта аминокислотного скора белка аминокислотный скор каждой незаменимой аминокислоты в «идеальном» референтном белке ФАО/ВОЗ [16] принимали за 100%, а в исследуемом – определяли процент соответствия. Если значение скора для определенной аминокислоты ниже 100%, данную аминокислоту определяли как лимитирующую.

Результаты и обсуждение

Метод ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией работает на основе того факта, что аминокислоты являются катионами при рН 2,2, удерживаются ионообменной смолой колонки и при элюировании градиентом с повышением рН смываются с нее согласно изоэлектрическим точкам молекул. На выходе с колонки разделившиеся аминокислоты вступают в специфическую реакцию с нингидрином, при высокой температуре, с образованием окрашенного продукта, который количественно определяют используя фотометрическое детектирование при 440 нм – для пролина и 570 нм – для всех других аминокислот [1, 10, 12].

Анализ аминокислот проводят после кислотного гидролиза белков (кроме триптофана). Для более полного нахождения метионина и цистеина (с димером последнего – цистином), кислотный гидролиз проводят с предварительно окисленными (количественно) серосодержащими радикалами аминокислотных остатков. В результате образуются соответствующие продукты окисления – метионинсульфон и цистеиновая кислота. Данный метод позволяет определить 17 протеиногенных аминокислот (за исключением триптофана, разрушающегося при кислотном гидролизе, аспарагина и глутамина, которые гидролизуются в аспарагиновую и глутаминовую кислоты, соответственно). Сумма определяемых аминокислот включает свободные аминокислоты и аминокислоты, которые были связанные в составе белка до гидролиза [12]. Схема аминокислотного анализатора представлена на рисунке 1.

В исследуемой кормовой добавке было установлено содержание сырого протеина: 18,29%. Было определено содержание незаменимых и заменимых аминокислот. Аминокислотный состав кормовой добавки представлен в таблице 1.

Был рассчитан аминокислотный скор, соотношение незаменимых и заменимых аминокислот и определены лимитирующие аминокислоты. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Рисунок 1. Общая схема аминокислотного анализатора [1]

Figure 1. The General scheme of amino acid analyzer [1]

Таблица 1.

Аминокислотный состав кормовой добавки, г/100 г. протеина

Amino acid composition of feed additive, g/100 g of protein

Table 1.

Незаменимые аминокислоты | Essential amino acids

THR	LEU	ILE	VAL	MET	LYS	PHE	HIS
3,26	6,43	3,24	4,77	2,18	2,90	3,16	2,03
Заменимые аминокислоты | Non-essential amino acids
TYR	ASP	SER	GLU	GLY	ALA	ARG	PRO	CYS
2,33	6,76	3,97	12,04	6,00	6,71	6,93	3,08	1,38

Таблица 2.

Аминокислотный скор и соотношение незаменимых и заменимых аминокислот

Amino acid score and ratio of essential and non-essential amino acids

Table 2.

«Идеальный белок» ФАО/ВОЗ | «Ideal protein FAO/WHO»[9]							Незамени-
THR	LEU	ILE	VAL	MET 1 CYS	LYS	PHE 1 TYR	мые/заменимые
4	7	4	5	3,5	5,5	6	essential/non-es-
Аминокислотный скор | Amino acid score, %							sential
81,5*	91,9*	81,0*	95,4*	101,7	52,7*	91,5*	0,57

* – лимитирующая аминокислота

Исходя из результатов очевидно, что исследуемая кормовая добавка наименее полноценна по содержанию лизина, скор этой аминокислоты составил 52,7%. Среди основных протеиногенных аминокислот, лизин является одной из ключевых незаменимых аминокислот [1]. Лизин необходим для синтеза гемоглобина и нуклеопротеидов [17].

Аминокислотный скор изолейцина, лейцина и валина составил 81; 91,9 и 95,4% соответственно. Изолейцин, лейцин и валин являются аминокислотами, имеющими разветвленные алифатические цепи в радикалах. Их метаболизм интересен тем, что данные аминокислоты имеют общие пути катаболизма и, следовательно, могут создавать помехи друг другу при усвоении. Лейцин является сильным регулятором катаболизма аминокислот с разветвленной цепью, поэтому избыток лейцина в рационе нежелателен для животных [1, 3–4]. Лейцин и изолейцин обладают сильно выраженным кетогенным свойством. Валин связан с обменом холестерола, каротиноидов, метилмасляных кислот, служит источником образования гликогена и кофермента А [17]. Аргинин является незаменимым для молодых животных [1]. Установлено, что кормовая добавка содержит аргинин в количестве 6,93 г./100г протеина. Аргинин, превращаясь в орнитин (орнитиновый цикл, совокупность процессов образования мочевины), участвует в обезвреживании конечных продуктов азотистого обмена (аммиак), связан с функцией паращитовидных желез, служит источником образования креатина и креатинина, играя важную роль в энергетическом обмене [17]. Аминокислотный скор треонина составил 81,5%. Треонин, превращаясь в глицин, используется для синтеза протопорфирина, холестерола, жирных кислот и углеводов. В обмене веществ он тесно связан с лейцином и является антагонистом метионина и серина [17]. Аминокислотный скор суммы фенилаланина и тирозина составил 91,5%. Фенилаланин и тирозин являются «взаимо-превращаемыми» аминокислотами, имеющиеся данные показывают, что тирозин может частично обеспечить потребность в фенилаланине и наоборот [1]. Фенилаланин и тирозин служат источником образования в организме таких гормонов как тироксин, адреналин и норадреналин, а также пигментов меланинов. Нарушение обмена этих аминокислот сопровождается тяжелыми расстройствами общего обмена веществ, приводящими не только к снижению продуктивности, но и к гибели животных [17].

В представленной добавке аминокислотный скор более 100% был установлен лишь у суммы метионина и цистеина. Метионин участвует в ряде важных биосинтетических процессов, участвуя в обмене холина, креатина и адреналина через высвобождение метильной группы [1, 17]. Метионин является первой аминокислотой, встраивающейся в рибосомы при биосинтезе полипептидных цепей белков в клетках [10]. В настоящее время гистидин рассматривается как незаменимая аминокислота [1]. Установленное содержание гистидина в исследованной кормовой добавке составило 2,03 г./100г протеина. Гистидин необходим для синтеза гемоглобина, входит в состав карнозина и ансерина, содержащихся в мышцах. При декарбоксилировании гистидина образуется гистамин, являющийся физиологически активным соединением [17].

Полученные результаты свидетельствуют об относительно низкой биологической ценности (относительно референтного белка ФАО/ВОЗ) исследованной кормовой добавки по содержанию незаменимых аминокислот. Данная добавка может быть использована в кормлении сельскохозяйственных животных в комплексе с другими кормовыми компонентами, содержащими свободные аминокислоты и/или белки, в составе рациона, сбалансированного по содержанию незаменимых аминокислот.

Заключение

Исследование аминокислотного состава кормовых компонентов имеет важное значение в рационализации норм кормления сельскохозяйственных животных и балансировании рационов. В данной работе выполнен анализ