Исследование анеугенных эффектов с помощью панцентромерных зондов в условиях резидентного воздействия радона

Современные подходы к радиационной безопасности предусматривают наиболее полный учет всех источников ионизирующего излучения (ИИ) в среде обитания человека. Риски, связанные с воздействием относительно высоких доз (более 0,1 Гр), определяются по современной консенсусной оценке 5% на Зиверт. В то же время данная оценка, предусмотренная линейной беcпороговой концепцией, не характеризует в полной мере долговременное воздействие низких доз ИИ [1]. Низкодозовое воздействие включает ряд непрямых радиационных эффектов, в том числе «эффект свидетеля» и феномен увеличения генетической нестабильности. Данные риски нашли отражение в концепции наименьшего из возможных достижимых радиационных воздействий (ALARA) [2]. При этом низко интенсивные источники являются крайне сложными с точки зрения оценки биологических эффектов, но крайне важными, учитывая глобальные масштабы радоновой проблемы. Проблеме радона в современных исследованиях справедливо уделяется большое внимание как проблеме основного

радиационного фактора непрофессионального (резидентного) облучения населения Земли.

Радон – радиоактивный газ, признанный одним из наиболее опасных канцерогенов, действующих на организм человека. Его выделение в атмосферу происходит постоянно в результате распада природного изотопа урана-238. Очаги выделения радона расположены неравномерно на земной поверхности; их расположение зависит от географического положения объекта, форм микрорельефа, состава материнской горной породы, а также дефектов конструкции строений, используемых строительных материалов и т.д. В природных условиях радиоактивный газ быстро рассеивается в атмосфере и достаточно быстро распадается (период полураспада изотопа Rn222=3,82 суток), поэтому данный радиационный фактор не играет большой роли на открытой местности. Однако, закрытые пространства – жилые и производственные помещения – являются своеобразными «ловушками», которые способны накапливать радон, и его концентрация может в 10 раз превышать таковую на открытом воздухе. Это становится причиной серьезного радиоактивного облучения людей, находящихся в таких помещениях в течение длительного времени. Таким образом, радоновое облучение составляет не менее 50% от общего радиационного облучения современного человека.

Установлено, что облучение радоном может приводить к развитию рака легкого в условиях как профессионального, так и бытового облуче- ния людей. В настоящее время обсуждается роль низкодозового облучения радоном в индукции лейкемии [3], немеланомного рака кожи [4] и злокачественных образований желудочно-кишечного тракта [5].

Микроядерный тест в условиях цитокине-тического блока признан простым и эффективным методом, который позволяет выявить хромосомные нарушения в результате воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды. В настоящее время он является одним из основных методов биологической дозиметрии, также как и метод оценки частоты дицентри-ческих хромосом [6,7]. Оба метода показывают наличие стабильной корреляции с суммарной поглощенной дозой ионизирующего излучения, накопленной объектом.

Информативность метода микроядерного теста была повышена за счет дискриминации между спонтанными и кластоген-индуцированными микроядрами (МЯ) [8,9] – современная методика флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с панцентромерными зондами, которые связываются специфически с областью центромеры. Микроядра (МЯ), содержащие метки, обозначаются С+, не содержащие С-, соответственно.

Этот же метод позволяет провести косвенный анализ потерь хромосом и их фрагментов в клетках. По сравнению с ним, обычная рутинная окраска не дает возможности различить микроядра, вызванные поломками в хромосомном материале, и микроядра, вызванные анеуплоидией. Кроме того, рутинные методы не позволяют оценить степень тяжести хромосомного повреждения, так как невозможно определить, содержится в ядре целая хромосома или только ее часть.

Однако, данный метод делает цитоплазму трудно различимой при микроскопировании вследствие специфики подготовки препаратов. Поэтому стандартный подход подсчета числа микроядер в фиксированном количестве клеток, основанный на дифференцировке двуядерных клеток от клеток других типов, не представляется возможным. Вследствие этого, ряд исследователей предпочитают подход, основанный на подсчете определенного числа микроядер, с последующим расчетом доли центромер-пози-тивных МЯ [10, 11].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследованная выборка

Материалом для исследования послужили образцы биоматериала, полученные у 52 жителей г. Кемерово, не занятых на вредных производствах. Одновременно проводилось измерение радиационных параметров: объемной активности радона (ОА 222Rn) в воздухе жилого помещения и показатель бета- и гамма-фона.

Всего было обследовано 26 мужчин (средний возраст – 30 лет, от 24 до 41 года) и 26 женщин (средний возраст 36 лет, от 24 до 50 лет).

Исследование проводили, руководствуясь требованиями Комиссии по этике Кемеровского государственного универсистета. Протокол заседания комиссии по этике утвержден на заседании Комиссии № 4 от 10.10.2016 г. Участники исследования подписывали форму информированного согласия, содержащую информацию о целях исследования.

Микроядерный тест

Образцы венозной крови собирались в гепа-рин-содержашие вакутейнеры объемом 4 мл и хранились при температуре 4 'С не более 24 часов до культивирования. Образец цельной крови объемом 200 мкл переносился в культуральный флакон площадью 25см2 (TPP, Швейцария). Культуральная среда включала 3 мл RPMI-1640 (Па-нэко, Москва), 0,8 мл эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, США), 55 ЕД/мл пеницилли-на-стрептомицина. Фитогемагглютинин добавлялся в концентрации 30 мг\флакон, и культуры инкубировались в течение 44 часов при 37% в атмосфере 5% CO2. На 44-м часу добавлялся цитохалазин В (Aplichem, США) в концентрации 6 мг\ мл. Затем клетки культивировались еще 24 часа, после чего переносились в пробирки и обрабатывались 0,125М KCl в течение 30 с. Затем добавлялся 1 мл свежего фиксатора Карнуа (3 части метанола на 1 часть ледяной уксусной кислоты). После 3 смен фиксатора (5 мл фиксатора Карнуа), клеточные суспензии помещались на хранение при -20 'С [12]. Супернатант при этом удалялся после центрифугирования, объем клеточного осадка не превышал 200 мкл. Суспензии раскапывались на холодные сухие стекла, окрашивались азур-эози-ном и анализировались с помощью микроскопа Nikon Eclipse 80i в проходящем свете при увеличении 1000х с использованием масляной иммерсии. Для каждого препарата исследовалась 1000 двуядерных клеток, учитывались клетки с микроядрами согласно протоколу, разработанному M.Fenech, 2000 [13].

Флуоресцентная гибридизация (FISH)

Для приготовления препаратов использовали сухие стекла, на которые раскапывалась клеточная суспензия. Полученные препараты отмывались трехкратно в 2х SSC (высокосолевой цитратный буфер) по 5 минут в 3-х кюветах Шиффердеккера. Далее на 5 минут предметные стекла помещались в раствор пепсина для гидролиза белков (0,01% пепсина (70 мл воды + 70 мкл 10% пепсина + 70 мкл HCl (к)), раствор применяется теплым при 37 'С). Затем препараты фиксировались в течение 10 минут в параформальдегиде (0,5 г сухого параформальдегида + 50 мл 1х PBS + 5 мкл 5 M NaOH) и отмывались 5 минут в 1х PBS буфере (Amresco, США).

После этого стекла высушивались в батарее спиртов (70%, 80%, 96/100%) по 5 минут в каждом из сосудов. После стекла просушивали на нагревательном столике. Наносили по 10 мкл зондов на стекло, убирали пузыри, накрывали покровным стеклом, после чего заклеивали края стекла быстрозатвердевающим клеем. Препараты с нанесенными зондами помещались в ги-бридайзер (Termobrite, США) в условиях влажной среды на 5 мин при 75 градусах, от 16 до 24 часов при 37 градусах. Режим Denat and Hyb. После гибридизации флуоресцентные зонды надежно связывались с маркерным участком, для предотвращения быстрого выцветания флуорофора проводили обработку. Готовили WT1 (2 мл 20х SSC + 98 мл воды + 300 мкл Nonidet) и WT2 (10 мл 20х SSC + 90 мл воды + 100 мкл Nonidet), NONIDET P-40 (NP40) – мягкий неионный неденатурирующий детергент [14].

С предметных стекол снимали покровные и помещали в разогретый до 72 'С раствор WT1. Дальнейшие операции с препаратами проводились в темноте. Стекла экспонировались в растворе WT2 в течение 5 минут. После просушивания препаратов от остатков воды добавляли каплю реактива Prolong Gold antifade with DAPI. Затем на препараты наносили быстросохнущий лак.

Полученные препараты просматривались на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss Axio Imager 2 при увеличении 1000. Критерии отбора двуядерных лимфоцитов и учет микроядер проводили согласно стандартной методике. Учитывалась 1000 двуядерных лимфоцитов на каждом препарате. Микроядро со светящейся меткой содержит центромеру.

Статистические методы

Статистический анализ данных проводили с использованием пакета Statistica 10.0. Для количественных показателей рассчитывались средние значения и пределы 95% доверительного интервала (ДИ 95). Сравнение групп выполняли с использованием U-теста Манна-Уитни. Уровень значимости был принят на уровне 5%. Корреляцию между показателями для случая непараметрических данных рассчитывали с использованием коэффициента корреляции Пирсона для рангов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среднее значение объемной активности (ОА) радона в воздухе помещений составило 113,5 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,11 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,5 с-1.

Установлена средняя частота двуядерных клеток с микроядром (15,4‰). Доля С+ составила 23,9% (табл. 1). При этом значимых различий в частоте показателей между группой мужчин и женщин не обнаружено.

Частота клеток с микроядром увеличивалась с возрастанием ОА радона в воздухе помещений. Доля центромер-позитивных микроядер также возрастала в группе обследованных с уровнем ОА более 200 Бк/м3 в сравнении с первой группой (менее 50 Бк/м3) (табл. 2).

Также была рассчитана возможная корреляция между исследованными показателями и ОА радона (рисунок 1). Отмечена корреляция между долей 2-ядерных клеток с МЯ и ОА радона в воздухе (р=0,0026), в то же время доля С+МЯ несколько увеличивалась с возрастанием ОА, однако данная тенденция не подтверждена при расчете коэффициента корреляции (р=0,48). Не было найдено корреляции между частотой

Таблица 1. Частота микроядер и доля центромер-позитивных микроядер в обследованной группе

MN %о, [95% ДИ]		c+ MN, %, [95% ДИ]
Муж	Жен	Муж	Жен
14,0 [10,2-17,8]	16,9 [13,1-20,7]	21,3 [14,2-28,3]	26,6 [19,6-33,7]
N=26	N=26	N=26	N=26

Примечание. Приведено значение частоты двуядерных лимфоцитов с микроядром (‰), а также доля центро-мер-позитивных микроядер (%) и 95% доверительный интервал (ДИ)

Таблица 2. Частота 2-ядерных клеток с микроядром и доля центромер-положительных микроядер (С+МЯ/С-МЯ) в условиях разного уровня радона в помещении

ОА радона в воздухе помещения, Бк/м3	N	Частота 2-яд. с МЯ, %о (95% ДИ)	Доля С+ МЯ, % (95% ДИ)
<50 Бк/м3	14	11,1 [6,0-16,2]	18,4 [8,9 - 28,0]
50 - 100 Бк/м3	16	15,9 [11,2 -20,7]	26,5 [17,6 - 35,4]
100 - 200 Бк/м3	16	18,1 [13,3-22,8]	22,1 [13,2 - 31,0]
>200 Бк/м3	6	17,2 [9,4-24,9]	34,7 [20,2 - 49,3]
Всего	52	15,4 [8,0-11,9]	23,9 [15,1 - 22,3]

Примечание. Приведена частота микроядер (‰) и доля центромер-позитивных микроядер (%) и 95% доверительный интервал (ДИ)

%, MNC+

Рис. 1. Корреляция частоты 2-ядерных клеток с микроядром и доли центромер-положительных микроядер (С+МЯ/С-МЯ) с ОА радона в помещении

Концентрация радона, Бк/мЗ: MNC+ (%) - г = 0,0987; р = 0,4865.

Концентрация радона, Бк/мЗ: MN (%0) - г = 0,4092; р = 0,0026.

микроядер в двуядерных лимфоцитах и долей центромер-позитивных микроядер и возрастом обследованных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Показатели цитогенетических повреждений считается чувствительным к воздействиям различных факторов, включая накопленную дозу радиации. Накопленная доза радиации может приводить к формированию разрывов ДНК, не-репарированные разрывы могут приводить к формированию цитогенетических аномалий. Микроядра формируются в результате отставания фрагментов хромосом или целых хромосом в анафазе деления. Данный метод показал хорошие перспективы в качестве средства оценки биологического эффекта накопленной дозы радиации, в частности отмечена чувствительность на уровне 0,25 Гр для показателя спонтанных микроядер. Данный подход показал эффективность при обследовании пострадавших в Чернобыльской аварии [15] и Стамбульской аварии (декабрь 1998 - январь 1999) [16].

Подавляющее большинство случаев формирования МЯ связано с их формированием в результате потери и не включения в дочерние ядра крупных фрагментов: ацентрических хромосомных фрагментов, ацентрических хроматидных фрагментов или целых хромосом. Подобные крупные фрагменты не прикрепляются к веретену деления во время сегрегации ядер [17]. Вокруг таких хромосом и их участков формируется ядерная мембрана, что придает микроядрам морфологическое сходство (за исключением размеров) с ядрами клеток после проведения окрашивания.

В дальнейшем микроядра могут провоцировать нарушение деления клетки вследствие активации путей репликации или репарации ДНК. Клетка может закончить свое существование путем апоптоза [18]. Возможно, процесс образования микроядер занимает важное место в геномной пластичности опухолевых клеток [19]. Высказывалось мнение, что вскоре после формирования микроядра в клетке, уничтожаются или вытесняются [20]. Более полное описание судьбы микроядер и содержащих их клеток, является приоритетным направлением будущих исследований.

Если процесс деления все же осуществляется, то содержащаяся в микроядре хромосома способна к нормальной репликации. При нормальной сегрегации в последующем митозе возможно образование двух нормальных диплоидных клеток. Также в некоторых случаях, в микроядре могут наблюдаться дефекты сегрегации и репликации, что может приводить к формированию двух дочерних клеток, одна из которых содержит сохранившееся микроядро. Если микроядро способно реплицироваться, но не может быть сегрегировано должным образом в последующем митозе, то клеточное деление ингибируется с формированием двуядерной клетки [21].

Образование ацентрических хромосомных фрагментов может быть обусловлено несколькими механизмами. Несколько десятилетий назад было установлено, что к симметричным и несимметричным хроматидным и хромосомным обменам могут приводить ошибки репарации разрывов двойной спирали ДНК. Таким образом образуются как хроматидные, так и хромосомные фрагменты. Небольшое количество хромосомных фрагментов может образоваться в результате ошибок процесса репарации разрывов молекулы ДНК. Это происходит в том случае, когда нагрузка, ведущая к повреждению ДНК, превосходит репаративный потенциал клетки. Вероятность ошибок репарации увеличивается при наличии ошибок гомологичной рекомбинации ДНК, в которой нарушения связаны с дефектами в соответствующих генах, таких как BRCA1 и BRCA2. Также известно, что разрывы ДНК, приводящие к образованию МЯ, могут быть неотрепарированы в связи с дефектами ферментов, связанных с репарацией по типу негомологичного слияния концов [22].

К формированию микроядер также могут приводить такие механизмы, как одновременное повреждение эксцизионной репарации (например, 8-оксо-диоксогуанозин), миноргые ошибочные основания, включаемые в состав нити ДНК (например, урацил), в том случае, если они находятся в непосредственной близости и на противоположной комплементарной нити ДНК. Действуя одновременно, эти события эксцизионной репарации приводят к разрывам двойной спирали ДНК и образованию МЯ, особенно в случаях, когда разрыв не заполняется (репарируется).

Знание этих процессов может быть использовано для увеличения чувствительности микроядерного теста путем конвертирования эксцизионно-отрепарированных повреждений ДНК в разрыв цепи ДНК и соответственно МЯ посредством обработки цитозин-арабонозидом (во время G1 фазы клеточного цикла), который ингибирует заполнение разрыва (репарацию разрыва) на стадии эксцизионной репарации. Таким образом, тест становится более чувстви- тельным к воздействию основных генотоксических агентов, индуцирующих образование ДНК-аддуктов.

Недавние исследования также показали, что формирование МЯ может быть связано с фрагментированным хромосомным материалом, образующимся во время формирования моста, растянутого и сломанного во время телофазы [23].

У здоровых людей микроядра в лимфоцитах обычно образуются как из ацентрических фрагментов, так и из целых хромосом в соотношении между 30 к 70% и 70 к 30% в зависимости от пола и возраста. Частота образования МЯ повышается с увеличением возраста; у женщин она в целом выше по сравнению с мужчинами. Половые хромосомы определяют повышение потерь хромосом в процессе митоза с возрастом. У женщин X-хромосома может составлять до 72% от всех МЯ, при этом 37%, по видимости, связано с дефектами кинетохора, что, вероятно, связано с инактивацией Х-хромосомы [24].

Одним из механизмов образования микроядер являются нарушения расхождения хромосом в анафазе. Например, вследствие гипометилирования цитозина в цетромерных и перицентромерных повторяющихся последовательностях (классические сателлитные повторы в перицентромерных регионах и повторы высшего порядка в центромерной ДНК). В норме классическая сателлитная ДНК подвергается метилированию остатками цитозина, но при синдроме ICF (иммунодефицит) метилирование не происходит, как и в результате обработки 5-азацидином (ингибитором ДНК-метилтрансферазы).

При гипометилированной цитозине перицентромерные регионы 1, 9 и 16 хромосом значительно удлиняются. Это служит причиной нарушения сегрегации хромосом, а также их потери и реализации в МЯ, вероятно, из-за неверной сборки кинетохора. Объединения кине-тохорных белков (например, CENPA и CENPB) в центромерах, обычно, связано со статусом метилирования цитозина, а также метилирования гистонов. В последнем случае уменьшение целостности гетерохроматина может помешать прикреплению микротрубочек к кинетохору.

Ключевая роль кинетохорных белков при соединении хромосом с нитями веретена деления может быть причиной того, что дефекты в ки-нетохорных белках и микротрубочках приводят к формированию микроядер из потерянных в анафазе хромосом. Отставшие хромосомы могут быть материалом для формирования МЯ также в случае дефектов веретена деления, дефектов чек-пойнт генов, контролирующих митоз, а также ненормальной амплификации центросом. Установлено, что дицентрические хромосомы, сформированные по итогам объединения концов теломер, зачастую способны вовлекаться в события сегрегации. Это происходит, если в анафазе центромеры дицентрических хромосом растягиваются к разным полюсам клетки с достаточными силами, чтобы оторвать хромосомы от веретена деления [25].

Для распознавания МЯ, образованных целыми хромосомами и ацентрическими фрагментами, использован метод панцентромерных ДНК-зондов. Специфичные хромосомные пробы позволяют разделять хромосомные потери, приводящие к формированию МЯ даже в случае отсутствия сформированных МЯ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Модифицированный метод микроядерного теста, который позволяет дифференцировать анеугенные и кластогенные эффекты, является перспективным методом биодозиметрии. Представленные данные являются частью проекта по исследованию влияния низкодозового облучения радоном на организм человека, и в дальнейшем планируется существенное расширение группы обследованных. Обнаруженное увеличение частоты микроядер с увеличением ОА радона может быть вызвано дополнительным хроническим экспонированием радоном. В то же время тенденция к увеличению доли центромер-позитивных микроядер в группе с наибольшим уровнем радона не получила статистического подтверждения, что не исключает перспектив подобного показателя для оценки хронического экспонирования радоном.