Исследование аномалий в клетках буккального эпителия у пациентов с красным плоским лишаем слизистой оболочки рта и губ

¹Введение. Красный плоский лишай слизистой оболочки рта и красной каймы губ (КПЛ СОР и губ) — тяжелое заболевание, отличающееся неуточненным этиопатогенезом, упорным течением и возможностью опухолевой трансформации. Проблемы, связанные с ранней диагностикой и лечением КПЛ, вызывают профессиональный интерес у врачей в области дерматологии, онкологии и стоматологии. Среди заболеваний слизистой оболочки рта КПЛ составляет от 17 до 35%, чаще всего выявляясь у женщин от 50 лет и старше [1]. Локализуется КПЛ на слизистой щек, языка, десны, иногда на слизистой неба и красной кайме губ.

Сложной клинической проблемой является поиск эффективных методик лечения непрерывно рецидивирующих тяжелых форм КПЛ СОР и губ, невосприимчивых к кортикостероидам. Тяжелым формам заболевания присущи острые воспалительные проявления и многолетняя болезненность, которая снижает качество жизни больных, нарушая также прием пищи. Следует отметить, что при эрозивно-язвенной форме повышен риск озлокачествления [2], в связи с чем представляется актуальным поиск критериев и маркеров ранней диагностики заболевания [3–5].

Цель: исследование частоты встречаемости клеток буккального эпителия с ядерными аномалиями у женщин в возрасте 50–60 лет, страдающих красным плоским лишаем; выявление спектра ядерных аберраций и анализ диагностической информативности исследуемых показателей при оценке риска осложнений.

Материал и методы. Исследования проводилось на базе кафедры стоматологии Института дополнительного профессионального образования ВГМУ им. Н. Н. Бурденко и кафедры генетики, цитологии и биоинженерии медико-биологического факультета ВГУ. Проведен анализ встречаемости ядерных аберраций в клетках буккального эпителия у 20 женщин в возрасте от 50 до 60 лет, больных красным плоским лишаем. В качестве контроля выбраны 10 женщин той же возрастной группы без данного заболевания.

Сбор эпителия со слизистой оболочки ротовой полости пациентов с красным плоским лишаем осуществляли из области поражения и выше линии смыкания зубов вне очага поражения стерильным шпателем. Изготовление препаратов и их анализ осуществляли по методике, описанной в работе В. Н. Калаева с соавторами (2012) [6]. Собранный материал наносили на обезжиренное предметное стекло, распределяя его так, чтобы получился равномерный слой. Образцы высушивали и окрашивали азур-эозином по Романовскому — Гимзе в течение 20 минут. Анализ полученных материалов проводили с помощью микроскопа Laboval-4 (Carl Zeiss, Jena). Всего исследовано 40 препаратов с анализом 45 738 клеток. Критические уровни значимости при проверке статистических гипотез: 0,05; 0,01; 0,001.

Согласно данным Л. П. Сычевой (2012) [6], все нарушения, фиксируемые при просмотре препаратов, классифицированы следующим образом:

• 1)    цитогенетические показатели (микроядро, протрузии типа «язык» и «разбитое яйцо»);

• 2)    показатели деструкции ядра (перинуклеарная вакуоль, кариопикноз, кариорексис, кариолизис);

• 3)    показатели пролиферации (насечка).

Для статистической обработки данных использовали пакеты прикладных компьютерных программ Statis-tica 6.0 и Stadia. Изучаемые данные соответствовали нормальному закону при проверке с помощью крите-

рия Шапиро — Уилка, который применяется при исходно неизвестном среднем значении и среднем квадратическом отклонении. Формат данных представлен в виде среднего значения и среднеквадратического отклонения (М±σ). Для поиска цитологических показателей с диагностической ценностью применяли ROC-анализ методом DeLongetal (программа MedCalc 17.1). Анализировали следующие параметры: AUC (area under curve) — площадь под кривой (характеризует диагностическую ценность показателя (0,9–1,0 — отличная; 0,8–0,9 — очень хорошая; 0,7–0,8 — хорошая, 0,6–0,7 — средняя, 0,6 и меньше — неудовлетворительная)); чувствительность и специфичность теста, критические значения (cut-off point) показателей.

Результаты. В процессе исследования буккального эпителия у пациентов с КПЛ СОР и губ выявлено изменение количества клеток с ядерными отклонениями при сравнении с данными группы контроля (табл. 1).

Дисперсионный анализ позволил установить зависимость частоты встречаемости нарушений от наличия красного плоского лишая для признаков: «общая частота встречаемости всех нарушений», «показатели деструкции ядра», «число клеток с микроядрами».

Для признаков «общая частота встречаемости всех нарушений», «число клеток с микроядрами» обнаружена зависимость встречаемости нарушений от места взятия пробы у больного (в очаге поражения и вне его) (табл. 2).

Выявлено статистически значимое (р<0,05) увеличение числа клеток с патологиями у пациентов с КПЛ СОР и губ при сравнении с данными контрольной выборки (25,2±0,9%о). В области поражения болезнью количество клеток с аномалиями (28,1±1,3%) было больше по сравнению с теми областями буккального эпителия, которые находились вне данной зоны (24,0±0,7%). Различия данных вне зоны поражения с данными области поражения были статистически значимы при р<0,01. Выявляемость микроядер и клеток с деструктивными ядрами (кариопикноз, ка-риорексис) в буккальном эпителии области поражения была значимо выше, чем в контрольной группе.

Частота встречаемости таких показателей деструкции ядра, как перинуклеарная вакуоль, карио-лизис, в опытной группе была статистически значимо ниже по сравнению с контролем.

Следует отметить, что количество клеток с деструкцией ядра отличалось от контрольных данных у больных женщин и вне очага поражения; для показателей «число клеток с микроядрами» и «общее число нарушений» оно было выше только в очаге поражения.

Изменение числа клеток с патологиями, обусловленными деструкцией ядра, как в очаге поражения, так и вне его свидетельствует о генерализованности воздействия заболевания, вызывающего ядерные аберрации в клетках во всей ротовой полости.

Однако появление ядерных аномалий относится к редким событиям, и распределение частот их встречаемости не подчиняется нормальному закону. Поэтому наблюдается широкий размах варьирования исследуемых признаков: 95%-е доверительные интервалы значений изучаемых показателей у больных красным плоским лишаем перекрываются с таковыми в группе здоровых обследуемых, что затрудняет использование полученных данных в качестве референсных значений для диагностики патологического процесса в тканях ротовой полости.

Применение ROC-анализа позволило разрешить данную методическую проблему и оценить диагностическую ценность отдельных цитогенетических признаков для выявления патологии.

Таблица 1

Частота выявления нарушений в буккальных эпителиоцитах у женщин, страдающих красным плоским лишаем, и в норме (М±σ), ‰

Результаты дисперсионного анализа частоты выявления клеток с ядерными аномалиями в буккальном эпителии пациентов с красным плоским лишаем

Диагностическая ценность некоторых цитогенетических показателей для постановки диагноза «красный плоский лишай»

Нарушения		Опыт		Контроль
		Вне очага поражения	Зона поражения
Цитогенетические показатели	микроядро протрузия типа «разбитое яйцо» протрузия типа «язык»	2,2±0,2 1,0±0,2 0,5±0,2	2,7±0,1** 1,0±0,3 0,8±0,1	2,0±0,3 0,9±0,3 1,0±0,3
Показатели деструкции ядра	перинуклеарная вакуоль кариорексис кариопикноз кариолизис	5,5±0,5** 3,1±0,7 #а 6,5±0,4** 0,1±0,1#а	5,88±0,45** 5,04±0,23# 6,94±0,82** 0,65±0,11	10,6±0,6 0,4±0,1 3,3±0,5 2,5±0,3
Показатель пролиферации ядра	насечка	5,0±0,3	5,06±0,31	4,7±0,3
Общая частота встречаемости всех нарушений		24,0±0,7*б	28,1±1,3*	25,2±1,0

П р и м еч а н и е : а — различия между частотой встречаемости нарушений в области поражения и вне области статистически значимы (р<0,05); б — различия между частотой встречаемости нарушений в очаге поражения и вне очага статистически значимы (р< 0,01); * — различия с контролем статистически значимы (р<0,05); ** — различия с контролем статистически значимы (р<0,01); # — различия с контролем статистически значимы (р<0,001).

Таблица 2

Нарушения		Способ анализа данных
		Без учета данных вне очага поражения	С учетом данных вне очага поражения
	микроядро	–	Влияние фактора *
Цитогенетические показатели	протрузия типа «разбитое яйцо»	–	–
	протрузия типа «язык»	–	–
	перинуклеарная вакуоль	Влияние фактора #	Влияние фактора #
Показатели деструк-	кариорексис	Влияние фактора #	Влияние фактора #
ции ядра	кариопикноз	Влияние фактора #	Влияние фактора #
	кариолизис	Влияние фактора #	Влияние фактора #
Показатель пролиферации ядра	насечка	–	–
Общая частота встречаемости всех нарушений		Влияние фактора *	Влияние фактора *

П р и м еч а н и е : * — влияние фактора статистически значимо при р<0,05; # — влияние фактора статистически значимо при р<0,001.

Таблица 3

Показатель	Площадь под кривой	Индекс Юдена	Чувствительность, %	Специфичность, %	Точка отсечения
Кариолизис	1,0	1,0	100,0	100,0	0,9
Кариорексис	1,0	1,0	100,0	100,0	1,1
Перинуклеарная вакуоль	0,98	0,9	90,0	100,0	7,0
Кариопикноз	0,91	0,9	90,0	100,0	5,9

Установлено, что для образцов, отобранных в районе зоны смыкания зубов, ни один из исследованных признаков не имеет диагностической ценности (площадь под кривой составляет не более 0,5). Учет общего количества нарушений позволяет диагностировать патологию с чувствительностью 80% и специфичностью 60%, используя в качестве точки отсечения значение 25,3^.

Для образцов, отобранных непосредственно в зоне поражения, наибольшую диагностическую ценность представляют показатели кариолизиса, ка-риорексиса, частоты встречаемости перинуклеарных вакуолей, кариопикноза (табл. 3, рис. 1–4).

Рис. 1. ROC-анализ показателя «кариолизис» для диагностики КПЛ СОР и губ

Рис. 2. ROC-анализ показателя «кариорексис» для диагностики КПЛ СОР и губ

„ Sensitivity: 90,0 gQ _ Specificity: 100,0

. Criterion: <7,02

60 -

<л

ф

V)

40 -

20 -

О

10О-Specificity

. Sensitivity: 90,0 gn _ Specificity: 100,0

Рис. 4. ROC-анализ показателя «кариопикноз» для диагностики КПЛ СОР и губ

Рис. 3. ROC-анализ показателя «перинуклеарная вакуоль» для диагностики КПЛ СОР и губ

Анализ полученных результатов позволил установить, что показатели частот встречаемости признаков кариолизиса и кариорексиса в клетках тканей в области поражения КПЛ СОР и губ имеют абсолютную диагностическую ценность: чувствительность и специфичность тестов составляет 100%, что исключает получение и ложноотрицательных, и ложноположительных результатов (см. рис. 1, 2).

Дополнительным подтверждением диагноза может служить определение частот выявления перинуклеарных вакуолей и кариопикнозов (см. рис. 3, 4).

Чувствительность представленных тестов равна 90% при 100%-ной специфичности. Это означает, что возможность гипердиагностики снижается, а вероятность получения ложноотрицательных результатов исключается.

Таким образом, для выявления КПЛ СОР и губ у лиц женского пола в возрасте от 50 лет и старше 60 лет можно использовать значения частот выявления диагностически информативных ядерных изменений в клетках буккального эпителия в области поражения (табл. 4).

Обсуждение . Проведенные авторами исследования свидетельствуют об увеличении количества клеток с аномальными микроядрами у женщин в возрасте старше 50 лет с КПЛ СОР и губ по сравнению с группой контроля, что согласуется с результатами работы, проведенной M. Mukherjee с соавторами [2].

Существует ряд работ, посвященных изучению связей между патологическими процессами и частотой выявления клеток с аномальными ядрами в буккальном эпителии человека], так как он является сво-

Таблица 4

Значения частот встречаемости прогностически информативных ядерных аномалий в клетках буккального эпителия у женщин старше 50 лет, рекомендуемых для диагностики КПЛ СОР и губ, ‰

Аномалия ядра Больные Здоровые Кариолизис <0,9 >0,9 Кариорексис >1,1 <1,1 Перинуклеарная вакуоль <7,0 >7,0 Кариопикноз >5,9 <5,9 еобразным «зеркалом» состояния всего организма [4, 6–9].

S. Grover с соавторами [10] сравнивали частоты встречаемости микроядер у больных КПЛ СОР и губ, лейкоплакией и подслизистым фиброзом ротовой полости при разных способах окрашивания. При использовании всех типов красителей найдены статистически значимые различия между контрольной и исследуемыми группами.

Некоторые ученые указывают на возможность использования параметра «число клеток с генетическими аномалиями» в качестве маркера озлока-чествления при ранней диагностике онкологических заболеваний, а также при выявлении онкогенных факторов [10–13].

Более высокие значения частот выявления клеток с микроядрами в области поражения свидетельствуют о нарастании в нем генетической нестабильности, что может способствовать озлокачествлению этих клеток. Данный факт отмечается рядом автором при исследовании предраковых состояний [11, 12]. Например, красный плоский лишай является предшественником карциномы ротовой полости [5, 13, 14]. Собственные исследования и данные научной литературы [2, 13, 14] свидетельствуют о том, что злокачественные опухоли у таких больных встречаются в 2-3% случаев.

Микроядерный тест буккальных эпителиоцитов, являясь легкодоступным для сбора образцов; нетравматичным для забора материала, не требуя высокотехнологичного оборудования, может помочь при ранней диагностике красного плоского лишая. Выявив частоты встречаемости нарушений при данном заболевании и сравнив их с таковыми у здоровых людей, можно определить, при каких значениях велик риск развития КПЛ СОР и губ.

Выводы:

• 1.    Общее число клеток с аномалиями, а также частоты встречаемости некоторых ядерных аберраций (микроядер, кариорексиса, кариопикноза) были выше у женщин, больных красным плоским лишаем, а частоты встречаемости некоторых показателей деструкции ядра (кариолизис и перинуклеарные вакуоли) были ниже, чем в контрольной группе.

• 2.    Повышение частоты встречаемости клеток с микроядрами в очаге поражения красным плоским лишаем свидетельствовало о нарастании генетической нестабильности, которая запускает процесс их озлокачествления в 2-3% случаев.

• 3.    На основании проведенного ROC-анализа можно рекомендовать ядерные аберрации, связанные с деструкцией ядра, к использованию в качестве маркеров для идентификации патологически измененных тканей при заболевании красным плоским лишаем. Для подтверждения диагноза также можно рекомендовать определение частот встречаемости

• 4.    Контроль динамики частот встречаемости ка-риопикнозов и кариорексиса в процессе развития заболевания позволяет оценить эффективность применяемой терапии, своевременно корректировать ее и прогнозировать риск развития злокачественных новообразований.

перинуклеарных вакуолей и кариопикнозов в клетках из зоны поражения.