Исследование антигипоксических свойств производных фосфорилуксусной кислоты

Показано, что производные фосфорилуксусной кислоты ХС 3 587, ХС 3 567 и ХС 3 635 в дозах 10 5 моль/кг, в отличие от КАПАХ, проявляют выраженные антигипокси-ческие свойства на модели гиперкапнической гипоксии у мышей. Эффективность ХС 3 587, ХС 3 567 и ХС 3 635 в условиях данной экспериментальной патологии примерно равнозначна. Методом спектроскопии комбинационного рассеивания в опытах in vitro доказана способность вещества ХС 3 635 в диапазоне концентраций 5,0 — 50,0 мкг/мл повышать содержание оксигемоглобина в эритроцитах периферической крови и увеличивать способность дезоксигемоглобина связывать кислород. Выявленные эффекты исследуемых веществ могут частично объяснять кардиопро-текторные, нейропротекторные и стресспротекторные свойства производных фосфорилуксусной кислоты, продемонстрированные в ранее опубликованных работах.

Химические соединения, обладающие ан-тигипоксическими свойствами, представляют важный резерв для создания потенциальных противоишемических и церебропротектор-ных средств. В связи с этим в программах доклинических исследований потенциальных представителей данных лекарственных групп тестирование веществ на способность пролонгировать выживаемость экспериментальных животных на различных моделях гипоксий занимает важное, часто ведущее место [9]. Интересный ряд химических соединений представляют собой производные фосфорилуксусной кислоты [7]. Согласно ранее полученным данным, некоторые из этих веществ проявляют кардиопротекторные [1], противоаритмические [10; 12] и стресспротекторные [6] свойства. Однако остается невыясненным, присутствует ли в их фармакодинамике антигипоксическая составляющая.

Целью исследования явилось изучение антигипоксических свойств наиболее эффективных представителей производных фосфорилуксусной кислоты.

Материалы и методы. Работа выполнена на 50 половозрелых мышах обоего пола массой 18 — 20 г и крови доноров (пять проб по четыре серии в трех повторностях). Антигипоксическая активность изучена на модели гиперкапнической гипоксии при помещении животных в сосуды объемом 200 мл; опреде ляли время «положения на бок». Исследовали четыре химических соединения — производных фосфорилуксусной кислоты под лабораторными шифрами КАПАХ, ХС 3 587, ХС 3 567 и ХС 3 635. Вещества синтезированы в Казанском государственном технологическом университете кандидатом химических наук ведущим научным сотрудником Р. И. Тарасовой и предоставлены нам автором. Фармакологическую активность всех соединений оценивали в дозах, соответствующих 10 5 моль/кг.

Для выявления некоторых аспектов влияния тестируемых производных фосфорилуксусной кислоты на процессы транспорта кислорода гемоглобином использовали метод спектроскопии комбинационного рассеяния (КР). Измерения проводили на рамановском спектрометре in via Basis фирмы «Renishaw» с короткофокусным высокосветосильным монохроматором (фокусное расстояние не более 250 мм) [4]. Для возбуждения рамановских спектров использовали лазер с длиной волны 532 нм и мощностью излучения 100 мВт. Регистратор данных — CCD-детектор (1 024 х 256 пикселей) с решеткой 1 800 штр/мм. Оцифрованные спектры обработаны в программе WIRE 3.3. В контрольных опытах в мазок крови донора добавляли каплю 0,9% раствора хлорида натрия, а в опытных сериях — растворы

ХС 3 635 в конечных концентрациях 5, 50 и 500 мкг/мл.

Для анализа конформации гемопорфирина и О2-связывающих свойств гемоглобина использовали определенные характерные полосы спектра КР: 1 355, 1 375, 1 548 — 1 552, 1 580 — 1 588 см '. Полосы 1 355 и 1 375 см 1 опосредованы симметричными колебаниями пиррольных колец в молекулах дезоксигемоглобина и оксигемоглобина соответственно. Определяли соотношение интенсивностей / 375/(Л 355 + Л 375^> отражающее относительное количество оксигемоглобина в крови. Полосы 1 548 — 1 552 и 1 580 — 1 588 см 1 связаны с колебанием метиновых мостиков между пирролами в молекулах гемоглобина с растянутым и деформированным гемопорфирином соответственно. Отношение интенсивностей / 355/ Л । 550 свидетельствует об от носительной способности всего гемоглобина в пробе связывать О2, а соотношение / 375/ / 580 — об относительной способности гемоглобина освобождать О2 [3; 8].

Полученные данные обработаны с использованием t -теста Стьюдента [2].

Результаты. Результаты экспериментов на модели гиперкапнической гипоксии представлены в табл. 1. Нами выявлена различная эффективность исследуемых соединений в условиях данной экспериментальной патологии. КАПАХ не оказывал статистически достоверного влияния на регистрируемый показатель, тогда как ХС 3 587, ХС 3 567 и ХС 3 635 проявили заметные антигипокси-ческие свойства. Выраженность фармакологического эффекта всех соединений была примерно одинакова и статистически однородна.

Таблица 1

Активность производных фосфорилуксусной кислоты на модели гиперкапнической гипоксии у мышей

Примечание. * — отличия от контроля достоверны при р < 0,05.

Согласно ранее полученным нами данным, КАПАХ проявляет наименее выраженные противоишемические и противоаритми-ческие свойства [10], тогда как высокая ан-тигипоксическая активность трех других исследуемых соединений хорошо согласуется с их заметными кардиопротекторными [1], нейропротекторными [11]и стресспротектор-ными свойствами [5 — 6]. На основании полученных данных можно высказать предположение, что одним из аспектов фармакодинамики ХС 3 587, ХС 3 567 и ХС 3 635 является способность веществ повышать устойчивость органов и тканей животных к дефициту кислорода.

Механизм антигипоксической активности теоретически может быть объяснен влиянием веществ на различные звенья транспорта кислорода кровью, его проникновение че рез аэрогематический барьер и утилизацию на уровне тканей, а также повышением устойчивости периферических тканей к дефициту кислорода. В рамках нашего исследования мы изучили влияние производных фосфорилуксусной кислоты на характеристики гемоглобина периферической крови подопытных животных на примере ХС 3 635 в условиях in vitro методом КР. Полученные данные представлены в табл. 2.

Как показали наши исследования, конечная концентрация ХС 3 635 уровня 5 мкг/мл не изменяет содержание оксигемоглобина в пробах, но является оптимальной для поддержания кинетики диссоциации кислорода. Так, способность дезоксигемоглобина присоединять кислород статистически достоверно увеличивается с 0,996 ± 0,076 до 1,070 ± ± 0,022. Напротив, способность оксигемогло- бина освобождать О2 несколько снижается. Последний факт, возможно, объясняется условиями проведения эксперимента. В тканях при значительно более низких напряжениях кислорода его диссоциация от гемопорфирина, очевидно, будет совсем иной.

Таблица 2

Соотношение интенсивностей полос спектра комбинационного рассеяния

Примечание. * — отличия от контроля достоверны при р < 0,05.

Использование ХС 3 635 в более высоких дозах (50 и 500 мкг/мл) сопровождается уменьшением количества оксигемоглобина в опытных образцах эритроцитов, что, на наш взгляд, можно интерпретировать как токсический эффект испытуемого вещества. Данное предположение подтверждает отсутствие положительных изменений со стороны такого показателя, как Ц 355 / I1 550 , который свидетельствует о степени сродства гемопорфирина дезоксигемоглобина к своему физиологическому лиганду.

Полученные нами данные с использованием метода спектроскопии комбинационного рассеяния согласуются с результатами О. Г. Луневой с соавторами [3], описавших уменьшение способности гемопорфирина в дезоксиформе связывать кислород при ишемии и постишемической реперфузии. Предполагается, что конформация гемопрофирина в наибольшей степени меняется в мембранносвязанном дезоксигемоглобине в результате изменения вязкости мембраны и нарушения белок-липидных взаимодействий. Так как эффекты ХС 3 635 в дозах 50 и 500 мкг/мл заметно напоминают эффекты ишемии, описанные в работе [3], видимо, можно утверждать о негативном действии тестируемого соединения в высоких дозах. Эффекты ХС 3 635 в дозе 5 мкг/мл в некоторой степени могут служить объяснением антигипок-сических свойств вещества в опытах на модели гиперкапнической гипоксии.