Исследование антиоксидантной активности экстрактов чая электрохимическими методами

В настоящее время особое внимание уделяется изучению содержания антиоксидантов и их активности в чаях, лекарственных растениях и растительных добавках. Наиболее типичными представителями антиоксидантов в экстрактах чая и растительных добавках являются водорастворимые полифенолы [8]. Хотя их антиоксидантная активность связана с разными механизмами действия, наиболее распространенным является радикальный механизм взаимодействия полифенолов с активными кислородными радикалами [1].

За последнее время появились многочисленные публикации о профилактическом действии полифенолов чая в отношении онкологических заболеваний [7, 9, 11] и значительном снижении риска развития ишемической болезни сердца и других сердечнососудистых заболеваний [12]. В [6] приведен широкий обзор работ, в которых различными методами определены состав чаев. Однако результаты определения суммарного содержания антиоксидантов и их активности в смесях экстрактов чаев с различными растениями практически отсутствуют. Такие исследования могли бы дать исследователям ценную информацию о возможном влиянии природных полифенолов в экстрактах смесей чая и растений друг на друга, так как известно, что антиоксиданты фенольного типа могут проявлять эффекты синергизма и антагонизма, усиливая или ослабляя тем самым свое действие [3].

Целью настоящей работы являлось определение суммарного содержания и биологической активности антиоксидантов в водных экстрактах некоторых видов чая и растительных добавок. Проводилось сравнение содержания антиоксидантов и их активности в экстрактах отдельных чаев и добавок с экстрактами смесей этих продуктов для исследования возможного влияния компонентов смесей друг на друга. В качестве методов исследования использовались экспрессные электрохимические методы анализа: амперометрический и вольтамперометрический.

Материалы и методы.

Пробоподготовка исследуемых объектов. Объектами исследования служили водные экстракты трех видов чая (китайского зеленого «Ресницы красавицы», серого с бергамотом «Earl grey tea» и черного цейлонского «Real»), мяты перечной (Mentha piperita L.) и высушенной лимонной цедры, а также экстракты бинарных смесей исследуемых объектов с разным соотношением компонентов.

Выбор данных объектов не случаен, поскольку они содержат большое количество биологически активных веществ. В чаях это катехины, теафлавины и теарубиги-ны, кофеин, различные аминокислоты, сахара (глюкоза, фруктоза и сукроза), витамины (С, Е, К, Р и группы В), фенольные кислоты (основная – галловая кислота), катионы и анионы щелочных и щелочноземельных металлов и металлокомплексы [6]. Мята содержит эфирное масло, дубильные и смолистые вещества, каротин, аскорбиновую кислоту, рутин (0,015%) и другие полифе-нольные соединения [2]. В лимонной цедре содержится лимонная и аскорбиновая кислоты, тиамин, рибофлавин, горькое вещество лимонин и др. [2].

Для проведения исследований образец измельчали в ступке до размера частиц 1-2 мм. Навеску измельченного образца (0,5 г) заливали дистиллированной водой объемом 50мл с температурой 950С. Экстрагирование проводили в течение 10 минут без термостатирования, экстракты тщательно отфильтровывали через бумажный фильтр «синяя лента», аналогично [10].

Амперометрический метод определения суммарного содержания антиоксидантов. Амперометрический метод, реализованный на приборе «Цвет Яуза-01-АА» (НПО «Химавтоматика», Москва), позволяет определить суммарное содержание антиоксидантов фенольного типа в исследуемых образцах [5]. Сущность данного метода заключается в измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности стеклоуглеродного электрода (СУЭ) при постоянном потенциале 1,3 В. При этом потенциале происходит окисление только групп -ОН природных антиоксидантов фенольного типа. Полученный сигнал (площадь под кривой тока) сравнивался с сигналом индивидуального антиоксиданта – галловой кислоты с известной концентрацией, измеренным в тех же условиях. Для этого предварительно строилась градуировочная зависимость сигнала образца сравнения (галловой кислоты) от его концентрации. Экспрессность метода позволила проследить динамику содержания антиоксидантов в исследуемых образцах непосредственно после экстракции.

Погрешность измерения содержания антиоксидантов составила не более 10%, а время измерения - 10 - 15 мин при наличии градуировки.

Вольтамперометрический метод определения суммарной антиоксидантной активности. Вольтамперометрический метод, реализованный на анализаторе «АОА-анализатор» (НПП «Полиант», Томск), в качестве модельной реакции использовался процесс электровосстановления кислорода (ЭВ О₂) на ртутнопленочном электроде, идущий по механизму, аналогичному восстановлению кислорода во многих объектах искусственного и природного происхождения [10]. Процесс ЭВ О₂ на ртутнопленочном электроде (РПЭ) идет в несколько стадий с генерацией на поверхности электрода активных кислородных форм.

В качестве критерия антиоксидантной активности исследуемых объектов использовался кинетический критерий К , который отражает количество кислорода и активных кислородных радикалов, прореагировавших с антиоксидантами во времени, мкмоль/л - мин:

K = — (1 - -)

t Iо где I, I0 — токи ЭВ О2, соответственно, в присутствии и в отсутствии АО в растворе, С0 — исходная концентрация кислорода в растворе (мкмоль/л), t — время экспозиции индикаторного электрода при постоянном потенциале предельного тока кислорода, характеризующее протекание реакции взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами.

Погрешность измерения данным методом с учетом повторяемости результатов составила 25% при числе параллельных определений n=5.

В качестве фонового электролита использовался фосфатный буферный раствор объемом 10 мл с известной исходной концентрацией молекулярного кислорода, куда добавлялось дозированное (V=30÷150 мкл) количество исследуемого образца.

Концентрация исследуемых экстрактов чая, добавок и их смесей в объеме буферного раствора соответствовала концентрации экстрактов, вводимых в амперометрическую ячейку прибора «Цвет Яуза-01-АА», для чего экстракты перед введением в ячейку прибора разбавлялись в 50-300 раз.

Результаты и обсуждение.

На рис. 1 и 2 приведены примеры амперограмм и вольтамперограмм, полученных в течение 10 минут при введении в ячейку исследуемого экстракта черного цейлонского чая. Видно, что в течение этого времени наблюдается уменьшение аналитического сигнала обоими методами, кроме того при вольтамперометрических исследованиях наблюдается сдвиг потенциала максимум тока ЭВ О 2 в положительную область относительно максимума тока фонового электролита.

Результаты измерений суммарного содержания фенольных антиоксидантов ( С мг/г в галловом эквиваленте) амперометрическим методом и кинетического критерия ( К, мкмоль/л мин) вольтамперометрическим методом для экстрактов чая, добавок и экстрактов их смесей в разном соотношении представлены на рисунках 3 и 4 соответственно.

Рис. 1. Амперограммы экстракта черного цейлонского чая.

не только для экстракта зеленого чая (1,46 мкмоль/л ⋅ мин), но и для экстракта мяты (1,50 мкмоль/л ⋅ мин), минимальный – для экстракта черного чая (0,31 мкмоль/л ⋅ мин).

Рис. 2. Вольтамперограммы тока ЭВ О2на РПЭ в фосфатном буфере(0.025M, pH 6.86) в отсутствии (1) и присутствии экстракта черного цейлонского чая (2).

Рис.3. Значения суммарного содержания антиоксидантов фенольного типа (а) и кинетического критерия (б) для экстрактов: 1 – зеленого китайского чая, 2 – серого чая с бергамотом, 3 – черного цейлонского чая , 4 – мяты, 5 – лимонной цедры.

Поскольку в экстрактах чая и мяты содержание фенольных соединений оказалось значительно больше, чем в лимонной цедре, можно предположить, что суммарная антиоксидантная активность экстрактов чая и мяты определяется фенольными соединениями. В пользу достаточно высокого содержания в чаях и мяте полифенольных соединений говорит и значительный

Кроме того, на рис. 4 представлены результаты суммарного содержания фенольных антиоксидантов и кинетического критерия рассчитаных по аддитивному вкладу содержания антиоксидантов компонентов смеси, в соответствии с их соотношением. Обобщенные результаты представлены в таблице 1.

Видно, что наибольшее содержание антиоксидантов фенольного типа имеет экстракт китайского зеленого чая (43,5 мг/г), наименьшее – экстракт лимонной цедры (1,4 мг/г). В отличие от содержания фенольных антиоксидантов, измеренного амперометрическим методом, кинетический критерий оказался максимальным сдвиг потенциала максимума тока восстановления кислорода в положительную область.

Что касается смесей чая и добавок, то значения содержания фенольных антиоксидантов в экстрактах смесей исследуемых объектов, измеренных экспериментально, значительно ниже в сравнении с аддитивным вкладом содержания фенольных соединений компонентов смеси, т.е наблюдается их сильный антагонизм. Особенно он значителен для экстрактов смесей чая или мяты с лимонной цедры (образец 4, 7, 9 и 10).

Рис.4. Значения суммарного содержания антиоксидантов фенольного типа (а) и кинетического критерия (б) для экстрактов смесей чая и добавок: 1 – чай 1 + чай 2 (1:1), 2 – чай 1 + чай 3 (1:1), 3 – чай 1 + мята (4:1), 4 – чай 1 + лимонная цедра (3:2), 5 – чай 2 + чай 3 (1:1), 6 – чай 2 + мята (4:1), 7 – чай 2 + лимонная цедра (3:2), 8 – чай 3 + мята (4:1), 9 - чай 3 + лимонная цедра (3:2), 10 – мята + лимонная цедра (2:3). В скобках указано соотношение между компонентами смесей.

В тоже время при исследовании суммарной антиоксидантной активности в экстрактах смесей вольтамперометрическим методом экспериментальные значения в большинстве случаев достаточно большие от вычисленных по аддитивности значений. По видимому в смеси антиоксидантов с однотипным действием и схожей активностью по отношению к процессу ЭВ О2 может наблюдаться явление кооперативного действия, а принцип аддитивности не работает, т.к. активность составляющих смеси имеет разную природу и механизм взаимодействия с кислородом и его радикалами, а на активность смесей влияют не только химические взаимодействия между веществами, но коэффициенты диффузии этих веществ к электроду и т.д.

По данным видно, что активность экстрактов смесей чая не очень меняется по сравнению с активностью экстрактов отдельных чаев, мята снижает активность зеленого чая (образец 3), лимонная цедра также снижают суммарную антиоксидантную активность экстрактов смесей (образец 4, 7), кроме смеси их с мятой, где влияние лимонной цедры оказалось незначительным (образец 10).

При экстрагировании смесей чая и добавок, в экстрактах происходят сложные биохимические реакции взаимодействия компонентов смесей между собой, приводящие, к образованию менее эффективных соединений, окисляемость которых, регистрируемая амперометрическим методом, ниже. Это – химический антагонизм [3]. Возможно, при экстракции смесей происходит конкуренция различных веществ, приводящая к меньшему экстрагированию некоторых из них. Кроме того, некоторые экстракты, например смесей чая с лимонной цедрой, всегда более обесцвечены по сравнению с чистыми экстрактами чая, что говорит о возможном разрушении теарубигинов, теафлавинов или других составляющих чая некоторыми соединениями лимонной цедры. Вероятно, эти причины и приводят к уменьшению содержания антиоксидантов фенольного типа в экстрактах бинарных смесей по срав- нению с аддитивными значениями. Что касается активности экстрактов смесей к кислороду и его радикалам, то она определяется, вероятно, главным образом теми соединениями, присутствующими в компонентах смеси, которые имеют более высокую активность и действуют эффективно даже при малых значениях концентраций.

Кроме того, в работе амперометрическим методом исследовалась динамика изменения суммарного содержания фенольных антиоксидантов для всех исследуемых образцов (рис. 5).

Рис.5. Динамика изменения содержания антиоксидантов (в галловом эквиваленте) в экстрактах: 1 – зеленого китайского чая, 2 – серого чая с бергамотом, 3 – черного цейлонского чая, 4 – мяты, 5 – лимонной цедры.

Наиболее значительное снижение концентрации фенольных антиоксидантов наблюдается в экстрактах чая (20-25%), что, по-видимому, связано с распадом в них нестойких фенольных соединений (катехинов, те-афлавинов, теарубигинов и др.). Для экстракта лимонной цедры содержание фенольных антиоксидантов значительно меньше и практически не меняется в первые моменты времени после экстракции.

Таблица 1

Значения суммарного содержания антиоксидантов фенольного типа и кинетического критерия К в экстрактах смесей чая и добавок

Название образца	С, мг/г эксперимент	С, мг/г расчетные данные	К, мкмоль/л ⋅ мин эксперимент	К, мкмоль/л ⋅ мин расчетные данные
Чай зеленый китайский (чай1)	43,5±2,2	--	1,46±0,28	--
Чай серый с бергамотом (чай 2)	19,2±1,5	--	0,68±0,14	--
Чай черный цейлонский(чай 3)	14,9±1,3	--	0,31±0,07	--
Мята перечная	20,6±0,7	--	1,5±0,32	--
Лимонные корки	1,4±0,1	--	0,45±0,08	--
Чай 1 + чай 2 (1:1)	25,6±2,6	31,3±2,5	1,48±0,32	1,07±0,28
Чай 1 + чай 3 (1:1)	23,3±1,7	29,2±2,4	1,31±0,21	0,89±0,26
Чай 1 + мята (4:1)	29,5±1,1	38,9±2,3	0,53±0,12	1,46±0,42
Чай 1 + лимонные корки (3:2)	16,2±1,6	26,7±2,2	0,68±0,21	1,06±0,25
Чай 2 + чай 3 (1:1)	12,9±1,1	17,0±1,8	0,81±0,06	0,50±0,12
Чай 2 + мята (4:1)	13,5±1,0	19,5±1,6	0,50±0,14	0,84±0,31
Чай 2 + лимонные корки (3:2)	7,1±0,6	12,0±1,5	0,48±0,09	0,59±0,11
Чай 3 + мята (4:1)	9,6±0,6	12,2±1,4	0,71±0,15	0,55±0,21
Чай 3 + лимонные корки (3:2)	6,4±0,5	9,5±1,3	0,78±0,15	0,37±0,01
Мята + лимонные корки (3:2)	5,5±0,3	9,0±0,8	1,42±0,41	1,08±0,10

Заключение.

В настоящей работе в водных экстрактах чая, мяты и лимонных корок и их бинарных смесях измерены суммарное содержание АО и их активность к кислороду и его радикалам амперометрическим и вольтамперометрическим методами. В экстрактах чая и его смесях обнаружено снижение содержания фенольных АО непосредственно после заварки. При определении активности экстрактов к кислороду и его радикалам выявлено, что доминирующим механизмом их взаимодействия с компонентами чая и мяты является каталитический механизм восстановления кислорода через образование промежуточных комплексов. Для экстрактов смесей чая с добавками обнаружено значительное отклонение экспериментально полученных значений содержания антиоксидантов и их активности в большинстве смесей от значений, рассчитанных исходя из принципа аддитивности этих параметров компонентов смеси.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (№ 14.B37.21.1183)