Исследование антиоксидантных свойств гуминовых кислот пелоидов

Одним из интересных и перспективных источников биологически активных веществ (БАВ) с точки зрения экономической и терапевтической эффективности являются пелоиды, в частности, низкоминерализованные иловые сульфидные грязи, представляющие собой сложный комплекс как неорганических, так и органических веществ. Преобладающим компонентом низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, ответственным за биологическую активность, являются гуминовые кислоты, которые в настоящее время получили широкое применение в ветеринарии, животноводстве, растениеводстве, как эффективные биостимуляторы и протекторы. Грязелечение применяется как в народной, так и официальной медицине при патологиях опорно-двигательного аппарата, центральной и периферической нервной системы, желудочно-кишечного тракта, ЛОР-органов, в гинекологии, андрологии. Однако нативная пелоидотерапия, являясь нагрузочной процедурой, имеет определенные ограничения в применении и даже противопоказания, обусловленные наличием у пациентов сопутствующих заболеваний. Кроме того, пелоидотерапия связана с пребыванием больных в районе месторождения лечебных грязей, что делает ее малодоступной для многих категорий больных.

В настоящее время существует возможность решения этих вопросов путем преформирования, то есть выделения из лечебных грязей биологически активных компонентов и создания на их основе лекарственных средств с целью их самостоятельного использования. Предпосылками для

такого решения являются многочисленные исследования по составу лечебных грязей и их биологической активности, раскрывающие роль гуминовых кислот как ключевого фактора терапевтического действия низкоминерализованных иловых лечебных грязей. Исследования, выполненные в разных странах в последние десятилетия, подтверждают, что одной из основных причин патологических изменений в человеческом организме, приводящих к преждевременному старению и развитию многих болезней, в том числе самых опасных, таких как сердечно-сосудистые и онкологические заболевания, является избыточное содержание в биологических жидкостях свободных кислородных радикалов (супероксид-анион, гидроксильный радикал, пергидроксильный радикал и др.). Постоянное повышенное содержание в межклеточных и внутриклеточных биологических жидкостях свободных радикалов создает условия для развития оксидантного стресса, выражающегося с биохимической точки зрения в том, что свободные радикалы окисляют стенки сосудов, белки, ДНК, липиды. Радикалы особенно активно взаимодействуют с мембранными липидами, содержащими ненасыщенные связи, и изменяют свойства клеточных мембран. Наиболее активные свободные радикалы способны разрывать связи в молекуле ДНК, повреждать генетический аппарат клеток, регулирующий их рост, что приводит к онкологическим заболеваниям. Липопротеиды низкой плотности после окисления могут откладываться на стенках сосудов, что вызывает развитие атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний. От воздействия свободных радикалов здоровый организм защищает естественная антиоксидантная система, содержащая ферментные и неферментные вещества, способные полностью нейтрализовать вредное воздействие радикальных форм кислорода. Снижение активности естественной антиоксидантной системы человека и, следовательно, возрастание концентрации свободных радикалов в организме связано со многими неблагоприятными факторами: это радиоактивное и ультрафиолетовое облучение, ухудшение экологической обстановки, широкое распространение социальных заболеваний (алкоголизм, курение, наркомания), постоянные стрессы, потребление загрязненной пищи, неконтролируемый прием некоторых лекарственных препаратов. Данные обстоятельства свидетельствуют о том, что исследование антиоксидантных свойств гуминовых кислот является актуальным.

Цель исследования: изучение антиоксидантных свойств гуминовых веществ пелоидов амперометрическим и манометрическим методом.

Объект исследования: фракции гуминовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей (пелоидов) различной концентрации.

В основе методов определения антиоксидантной активности лежат принципы прямого или косвенного измерения скорости или полноты реакции антиоксидантов с соответствующими реагентами, среди которых наибольший интерес представляет амперометрия и манометрия. Для количественного определения антиоксидантов наиболее надежным представляется амперометрический метод, так как он позволяет непосредственно измерить содержание всех антиоксидантов в пробе. Он основан на измерении электрического тока, возникающего при электрохимическом окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода при определенном его потенциале. В условиях амперометрического детектирования хорошо окисляются соединения, содержащие гидроксильные группы, предел их обнаружения лежит в интервале 10-9-1012 г, а в благоприятных условиях некоторые соединения определяются на уровне 10-15 г. Нами была измерена антиоксидантная активность растворов гуминовых кислот различных концентраций 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001%. В качестве стандарта использовали кверцетин.

Таблица 1. Значения величин суммарного содержания антиоксидантов

Значения сигнала гуминовых кислот 0,001% концентрации 516 нАс свидетельствует о том, что суммарное содержание антиоксидантов составляет менее 0,0001 мг/мл. С увеличением концентрации гуминовых кислот значения цифровых сигналов, а следовательно суммарное содержание антиоксидантов увеличивается. При концентрации гуминовых кислот 0,01% суммарное содержание антиоксидантов 0,00058 мг/мл, при концентрации 0,1% – 0,00387 мг/мл, а при концентрации гуминовых кислот 1% значение суммарного содержания антиоксидантов достигает 0,043 мг/мл. Полученная информация свидетельствует о том, что гуминовые кислоты обладают антиоксидантной активностью, величина которой возрастает с увеличением концентрации.

Изучение антиоксидантных свойств гуминовых кислот манометрическим методом проводилось на модельной реакции радикально-цепного инициированного окисления 1,4-диок-сана в стандартных условиях при температуре 348 К и скорости инициирования Vi = 1·10-7 моль/л•с в кинетическом режиме окисления, в качестве инициатора окислительных процессов выбран азодиизобутиронитрил (АИБН). Кинетические опыты проводили в стеклянном реакторе, в который загружали раствор инициатора в 1,4-диоксане, термостатировали при температуре 75°С несколько минут, затем следили за поглощением кислорода с помощью универсальной манометрической дифференциальной установки. Скорость окисления V0 определяли по тангенсу угла наклона кинетической кривой поглощения кислорода. Ингибированное окисление 1,4-диоксана проводили в присутствии ионола или образцов гуминовых кислот. В этом случае cкорость Vin0 определяли по начальному участку кинетической кривой. Скорость инициирования рассчитывали по уравнению Vi = ki·[АИБН], где ki – константа скорости инициирования, с-1. При расчете скорости инициирования полагали, что ki=2ekp, где kp – константа скорости распада АИБН, e – вероятность выхода радикалов в объем. При этом для kр принимали значение, измеренное в циклогексаноле: lg кр = 17,70 - 35/9(9 = 4,575Т10 3, e = 0,5. Таким образом, Vi =1•10-7 моль/л•с.

Рис. 1. Типичные кинетические кривые в зависимости от концентрации гуминовых кислот

Известия Самарского научного центра Российской академии наук, том 15, №3(3), 2013

Рис. 2. Зависимость скорости поглощения кислорода (1) и параметра ингибирования (2) от концентрации ГК в координатах уравнения (1)

Введение в реакционную смесь антиоксидантов приводит к снижению скорости окисления модельного субстрата вследствие обрыва цепи на молекулах ингибирующей примеси. Из представленных графиков следует, что в области концентраций 1-30 г/л с увеличением концентрации раствора гуминовых кислот происходит закономерное снижение скорости окисления 1,4-диоксана, что служит очевидным доказательством антиоксидантного действия пелоидопрепарата.

Выводы: результаты амперометрического и манометрического определения антиоксидантных свойств гуминовых кислот, низкоминерализованных иловых сульфидных грязей свидетельствуют о том, что они обладают антиоксидантной активностью. Практическое использование информации об антиоксидантной активности гуминовых кислот позволит использовать их как биологически активную субстанцию для лекарственных препаратов для лечения патологий, обусловленных нарушением окислительно-восстановительного гомеостаза организма, что обеспечит снижение заболеваемости, предупреждение преждевременного старения, что позволит увеличить продолжительность и повысить качество жизни.