Исследование белков, связывающих токсины гуанидинового ряда в морском черве Cephalothrix simula: поиск потенциальных антидотов морских токсинов

Тайваня и Юго-Восточной Азии. Однако все больше токсичных животных обнаруживается и в европейских водах. Их появление объясняется двумя факторами: использованием судами балластных вод и открытием Суэцкого канала, связывающего Индийский и Атлантический океаны. Немаловажную роль в распространении животных, содержащих гуанидиновые токсины, играют и глобальные катаклизмы, такие, как цунами. Так, в 2004 г. цунами, возникшее в Индийском океане, привело к появлению токсичных рыб фугу у берегов Таиланда [2].

Большую роль в распределении животных, содержащих гуанидиновые токсины, играет температура. Повышение или понижение температуры приводит к изменению скорости накопления токсина. Микробные популяции, являясь первоисточником гуанидиновых токсинов в морской среде, также в значительной степени зависят от внешних факторов, в том числе и от температуры. Исследования микробного состава различных органов токсичной рыбы фугу T. niphobles показали, что понижение температуры уменьшает разнообразие и выживаемость ассоциированных бактерий [3].

ТТХ и его аналоги являются водорастворимыми и термостабильными, т.е. термическая обработка морепродуктов не убирает, а более того увеличивает их токсичность [4]. Токсический эффект самого ТТХ в сотни раз выше цианистого калия, а антидота от отравления ТТХ-подобными токсинами на сегодняшний день не существует. Попытки поиска препаратов для лечения отравлений токсинами гуанидинового ряда предпринимаются и по сей день. Так, в 1984 г. Кру с соавторами предложили использовать антихолинэстеразные препараты (неостигмин и атропин) для ослабления симптоматики токсического эффекта [5]. Лекарственная терапия не доказала своего положительного эффекта. Еще одним перспективным антидотом являются антитела к ТТХ. Ксу с соавторами синтезировал моноклональные антитела и показал эффективность их использования в нейтрализации ТТХ и сакситоксина как in vitro, так и in vivo [6]. Однако антитела слабо связывали токсины и потому в медицинской практике так и не нашли применения в качестве лекарств против отравлений морепродуктами. Симптомами отравления токсинами гуанидинового ряда являются: перио-ральная нечувствительность, парестезия, паралич, дыхательная недостаточность, гипоксия, гипотония, брадикардия, рвота, раздражение пищеварительного тракта и др. [7]. В настоящий момент во всех случаях отравления морскими токсинами используется наблюдение и поддерживающая терапия [8]. Так, например, ТТХ выводится из организма в течение 4 дней вместе с мочой и в этот период, в наиболее тяжелых случаях отравления, пациенты находятся на искусственной вентиляции легких.

При поиске антидотов к токсинам гуанидинового ряда целесообразно обратить внимание на ТТХ-носящих животных и выяснить причины их резистентности к токсину. Существует две гипотезы возникновения такой резистентности. Было обнаружено, что белки некоторых наземных ТТХ-носящих животных, формирующие натриевый канал, мутированы, т.е. конформация канала изменена [9-11]. Из чего можно сделать вывод, что на такие мутированные каналы ТТХ не садится. Согласно второй гипотезе, резистентность связана с наличием ТТХ-связывающих белков. Белки, чувствительные к ТТХ и его аналогам, были выявлены в крабе Hemigrapsus sanguineus , в некоторых брюхоногих моллюсках [12] и в рыбах фугу Fugu pardalis [13] и Takifugu niphobles [14].

Немертины - единственные животные, которые целенаправленно используют токсин как «орудие лова» или защиты от врагов, и для этого накапливают его в определенных органах. Так, ультраструктурное изучение немертины Lineus alborostratus показало, что ТТХ-подобные токсины локализуется только в секреторных клетках покровного эпидермиса и в железистых клетках эпителия хобота [15]. Столь «жесткая» и «целенаправленная» локализация токсина косвенно указывает на наличие механизма и молекулярных структур, ответственных за его перенос и «удержание». Кроме того, изучение распределения ТТХ и его аналогов на ультра-микроскопическом уровне показало, что токсины ассоциированы с органоидами белкового синтеза - т.е. предположительно, токсины ассоциированы с белками.

Цель работы: произвести поиск токсин-связывающих белков в морском черве Cephalo-thrix simula , как потенциальных антидотов низкомолекулярных токсинов гуанидинового ряда из морских гидробионтов.

Методика исследований. Немертины C.simula были собраны в ризоидах бурых водорослей Saccharina sp. в заливе Восток залива Петра Великого (Японское море) в июле-августе 2016 г. Немертин содержали в аэрируемых аквариумах с проточной морской водой (t=17°C).

Для оценки концентрации гуанидиновых токсинов общую пробу из 5 немертин весом 102 мг тщательно растирали до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе (EMS, USA). К полученному гомогенату добавляли 0,1% водный раствор уксусной кислоты в соотношении 1:10 и помещали в ультразвуковой гомогенизатор HD 2070 (Bandelin Sonopuls, Германия) на 15 мин, с частотой 20 kHz, амплитудой 228 мкм, с рабочим циклом 0,8 с и интервалом 0,2 с. Полученный экстракт центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, а затем надосадочную жидкость упаривали в вакуумном испарителе при 500°С. Оставшийся после упаривания осадок доводили 0,1% водным раствором уксусной кислоты до 2 мл. Раствор затем фильтровали с помощью 3 кДа фильтров Microcon Ultarcel YM-3 (Millipore, США). Для удаления белковой фракции раствор нагревали до 85°С в течении 20 мин, затем коагулированные белки осаждали, а супернатант хранили при -80°С для дальнейших исследований.

Определение концентрации токсинов гуанидинового ряда проводили на культуре клеток мышиной нейробластомы Neuro-2a (ATCC, CCL131), предоставленной банком клеточных культур эукариот университета Лозанны (Швейцария). Культивация велась в среде Игла в модификации Дюльбекко DMEM (Gibco, США) содержащей 4,5 г/л D-глюкозы, а также глютамин, пируват и антибиотики - 1000 U/ml пенициллина и 10 mg/ml стрептомицина (Sigma, США), дополненной 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота FBS (Sigma, США). Культура клеток содержалась в СО 2 -инкубаторе при 37^oC, 5% CO 2 и 80% важности. Пассирование клеток проводилось по достижению 80% конфлюэнт-ности раз в 2 дня.

Для проведения эксперимента клетки 2-х дневной культуры собирали из культурального флакона с помощью 0,25% раствора трипсина на фосфатном буфере (PBS) pH 7,4 и ресуспендиро-вали в культуральной среде (DMEM + 5% FBS) до плотности 4х105 клеток/мл. Посев клеток производили в 96-луночный планшет (Greiner-Bio-One, Германия) по 50 мкл суспензии в каждую лунку, итоговое содержание клеток в каждой лунке составляло 2х104. Клетки преинкубировали 24 ч в СО2-инкубаторе при 37оС и 5 % СО2. После 24 ч преинкубации в каждую лунку добавили по 100 мкл тестовых и контрольных растворов и инкубировали 24 ч в СО2-инкубаторе при 37оС и 5 % СО2. Для приготовления тестовых растворов использовали среду DMEM с 5% FBS, содержащую различные разведения экстрактов C. simula, а также 133 цМ вератридина (Sigma, США) в ДМСО и 0,4 мМ водного раствора уабаина (Sigma, США). Оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью красителя МТТ (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue) (Sigma, США). Раствор красителя 5 мг/мл в PBS pH 7,4 стерилизовали фильтрованием через 0,22 мкм фильтр (Millipore, США) и добавили по 15 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. После инкубации в течение 4-х часов при 37оС и 5% СО2, образовавшиеся кристаллы формазана растворили добавлением 150 мкл изопропанола c 0,04 М HCl, и перемешиванием на шейкере PST-60HL4 (Biosan, Латвия) при 37оС и 450 rpm в течение 10 мин. Измерение поглощения растворенного красителя для каждой лунки, проводили на спектрофотометре ELx800uv (Bio-TekInstruments Inc, США) при длине волны 595 нм с референсной длинной волны 630 нм.

Определение содержания ТТХ осуществлялось при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) на хроматографе Shimadzu-LC20 с масс-детектором LCMS-2010EV. Колонка Ascentis Express C18 (зернение 2,7 мкм, длина 15 см и диаметр 2,1 мм). Температура колонки составила 50°C, скорость потока 0,2 мл/мин, элюирование градиентное, начальная фаза - метанол:вода:1% муравьиная кислота (5:90:5) в течении первых 5 мин, далее за 5 мин следовало линейное изменение состава до 90:0:5, и промывка такой системой в течении 20 мин. Образец вводился автосэмплером в объеме 5 мкл. Масс-детектор использовался в режиме ионизации распылением в электростатическом поле (ESI), напряжение на капилляре 4.5 кВ. Регистрация ионов в режиме селективного мониторинга (SIM) положительного иона [M+H]+ с m/z 320.1. Количество ТТХ рассчитывалось по площади пика по иону 320.1 с использованием калибровочной кривой, полученной при анализе стандартных образцов ТТХ (Alomone Labs Ltd., Израиль).

Для приготовления белковых экстрактов червей C. simula предварительно промывали водой, взвешивали и механически гомогенизировали в буферном растворе в соотношении 1:5, содержащего 1,25 мл 0,5 М Трис-HCl (pH=6,8), 0,1 мл 10% ДСН, 1 мл глицерина, 0,1 мл 0,2 М Na-EDTA, 7,55 мл H 2 O. Гомогенат центрифугировали 7 мин при 14000 g, затем отделяли супернатант, прибавляли к нему на каждые 100 мкл по 1 мкл ингибитора трипсина соевых бобов, 1,5 мкл 1М PMSF в ацетоне. Для получения делипидизиро-ванного образца полученный гомогенат встряхивали с хлороформом в соотношении 1:5 в течение 15 мин.

Для проведения дот-блота предварительно смоченную в метаноле мембрану помещали на 10 мин в трансфер буфер, точечно наносили три образца (делипидизированый экстракт C. simula , стандартный экстракт C.

Simula и бычий сывороточный альбумин (БСА), растворенный в буфере для образцов для положительного контроля) и выдерживали 2 ч во влажной камере. После этого отмывали мембрану в TBST (20 мМ Трис, 0,02% твин-20,9 г/л хлорида натрия, рН=7,4) 5 раз по 5 мин, помещали в 3% раствор молока (BioRad, США) в TBST на ночь при 4^оС. Затем инкубировали мембрану с раствором цитрата ТТХ в ТBST в соотношении 1:1000 в течение 2 ч, отмывали 5 раз по 5 мин в TBST. За этим следовало выдерживание мембраны в поликлональных IgG против ТТХ в разведении 1:200 в 0,5% растворе молока в TBST в течение 1,5 ч при непрерывном перемешивании. Мембрану отмывали 5 раз по 5 мин TBST. Затем вносили антитела против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1:200 в 0,5% растворе молока в TBST, инкубировали 1 ч при перемешивании. Мембрану отмывали 5 раз по 5 мин TBST, после чего вносили субстрат (1 мг/мл диаминобензидин (ДАБ) в фосфат-цитратном буферном растворе, (pH=7,5), перед внесением добавляли H 2 O 2 до концентрации 0,02-0,03%), инкубировали 5 мин при встряхивании. Для остановки реакции мембрану промывали дистиллированной водой 5 раз.

Для разделения белков в нативных условиях модифицировали ДСН-ПААГ-электрофорез, используя 10% разделяющий гель с уменьшенной в 10 раз концентрацией ДСН. Для приготовления 30 мл 10% разделяющего геля смешивали 7,5 мл 40% акриаламида (содержащего 0,8% метилен-бис-акриламида), 14,08 мл H 2 O, 7,5 мл 1,5 М Трис-HCl (pH=8,8), 0,03 мл 10% ДСН, 0,15 мл 0,2 М Na-EDTA, 21 мкл TEMED, 72 мкл 2% ПСА. Полученный раствор заливали между стеклянными пластинами, после окончания полимеризации отмывали гель дистиллированной водой, заливали 4% концентрирующий гель, для приготовления 10 мл которого смешивали 1 мл 40% акриаламида, 5,88 мл H 2 O, 2,5 мл 0,5 М Трис-HCl (pH=6,8), 0,01 мл 10% ДСН, 0,1 мл 0,2 М Na-EDTA, 0,0125 мкл TEMED, 400 мкл 2% ПСА. Образцы вносили по 520мкл в каждый карман геля, погруженного в электродный буферный раствор (0,025 M Трис, 0,192 M глицин, 0,01% ДСН, pH=8,3). В отдельный карман наносили стандарты молекулярных масс на 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 и 250 кДа (BioRad, США). Электрофорез проводили при силе тока 7 мА для концентрирующего слоя, 10 мА - для разделяющего. После окончания электрофореза гель оставляли на 1,5 ч в фиксирующем растворе. Белковые зоны окрашивали нитратом серебра.

После проведения нативного электрофореза гель инкубировали в буферном растворе для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 0,01% ДСН, 20% метанол) 15 мин. Затем гель помещали на нитроцеллюлозную мембрану и собирали сэндвич для переноса. Перенос проводили в течение 1,5 ч при силе тока 150 мА в буферном растворе для переноса. Затем оставляли мембрану в 3% растворе молока (BioRad, США) в TBST (20 мМ Трис, 0,02% твин-20, 9 г/л хлорида натрия, рН=7,4) на ночь при 4оС. Затем мембрану разрезали на полосы согласно схеме нанесения образцов в карманы геля при нативном электрофорезе, повторяли обработку мембраны по схеме, описанной в методике проведения дот-блота.

Результаты и их обсуждения. Согласно данным японских исследователей, немертины из рода Cephalothrix являются наиболее токсичными ТТХ-содержащими животными [16]. Однако токсичность экстрактов из С. simula сильно варьируется в зависимости от условий обитания немертин и инструментальных методов оценки токсичности. Асакава с соавторами показали недостаточно четкую сезонную зависимость концентрации ТТХ и его аналогов в С. simula, которая, тем не менее, демонстрирует, что наибольшей усредненной токсичностью обладают животные, выловленные в заливе Хиросима Японского моря в конце июня и в период с конца июля по начало сентября [16]. Также было отмечено, что в 80% исследованных немертин токсичность в среднем составляла более 1000 МЕ/г, в 45% - более 2000 МЕ/г, а диапазон концентрации ТТХ и его аналогов в полученных экстрактах варьировался от 169 до 25590 МЕ/г. Интересно, что корреляции между токсичностью и массой тела животных не было установлено.

Рис. 1. Концентрация ТТХ-подобных токсинов (А, Б, В) и детекция ТТХ-положительных структур в белковых экстрактах немертины C. simula (Г, Д):

А - Биотесты на культуре мышиной нейробластомы Neuro-2a. Б - Калибровочный график для ТТХ концентрации 50нг - 50мг/мл. В - Хроматограмма экстракта C. simula по иону m/z 320.1. Г - Дот-блот: I - БСА, II - белковый препарат немертины C. Simula, III - обезлипиженный экстракт C. simula. Д - Нативный электрофорез в ПААГ с минимальным количеством ДСН белковых препаратов немертины С. simula в 10 % геле, окраска нитратом серебра: I - стандарты молекулярных масс, II - белковый препарат С. simula , 0,2 мг, III - иммуноблоттинг этого же препарата

Для идентификации ТТХ и оценки токсичности немертин C. simula, были использованы методы ВЭЖХ-МС в сочетании с биотестированием на культуре клеток нейробластомы Neuro-2. Стоит отметить, что биотесты на культуре клеток позволяют определить концентрацию не только ТТХ, но и других токсинов, блокирующих потен-циал-чувствительные натриевые каналы (ПЧНК), таких как сакситоксин, цилиндроспермин, гуанотоксины I-IV и т.д., в то время как метод ВЭЖХ-МС детектирует только те токсины, для которых имеются тестовые стандартные образцы. В ходе биоиспытаний нами было показано, что экстракты C. simula, оказывают сильнейший эффект на культуру клеток, эквивалентный 30 нг ТТХ на 1/1000 часть экстракта, что соответствует

294 мкг/г тела животных или токсичности равной 1336 МЕ/г (рис. 1А). Методом ВЭЖХ-МС был определен только ТТХ, и его концентрация составила 100 мкг/г, что соответствует токсичности равной 445 МЕ/г (рис. 1Б, 1В). Суммируя полученные данные можно сказать, что кроме самого ТТХ в экстракте C. simula встречаются и другие ПЧНК-блокирующие токсины, концентрация которых эквивалента 196 мкг/г ТТХ. Для более точной качественной оценки токсинов гуанидинового ряда в экстракте С. simula необходимо провести дополнительные ВЭЖХ-МС анализы с использованием тестовых образцов на эти токсины.

В соответствие с ранее высказанной гипотезой о наличии у немертин С. simula специальных белков, обладающих ТТХ-связывающей активностью, дот-блот иммуноанализ позволил впервые установить наличие подобных соединений в немертинах. Нами было показано, что в экстрактах C.simula , полученных в ходе первичной очистки, а также в ходе дальнейшей очистки с использованием хлороформа для удаления липидов, присутствуют соединения, предположительно, белковой природы, обладающие способностью связывать ТТХ (рис. 1Г). Примечательно, что при использовании хлороформа для удаления липидов из экстрактов ТТХ-связыва-ющая активность этих соединений заметно снижается, возможно, вследствие взаимодействия соединений с органическим растворителем. Известно, что характер связывания с токсином у ТТХ-связывающих белков достаточно вариабелен и во многом зависит от условий экстракции белков. Матсуи с соавторами [13] показали, что белок из Takifugu niphobles теряет способность связывать ТТХ при добавлении даже небольших количеств уксусной кислоты до 0,05% и восстанавливает ее при нейтрализации. Йотсу-Ймашита с коллегами [17] выяснили, что связывание белка PSTBP из T. pardalis с [H]3STX — радиоактивно меченным структурным гомологом ТТХ - ингибируется на 20, 20, 60 и 80% в присутствии 10 мМ MgCl2, CaCl2, L-аргинина и креатина, соответственно. Нагашима с соавторами [18] продемонстрировали заметное ингибирующее влияние ряда детергентов, среди которых 1% додецилсульфат натрия, 1% дитеотрие-тол, 8М мочевина и 6М гуанидин гидрохлорид, на связывание ТТХ с белком из краба Hemigrapsus sanguineus .

Для подтверждения белковой природы обнаруженных веществ и для определения их молярной массы был использован метод нативного белкового электрофореза в полиакриламидном геле с минимальным количеством додецилсульфата натрия. Нами было показано, что ТТХ-связывающие белки из червя C. simula , которые являются первыми токсин-связывающими белками, обнаруженными в немертинах, обладают массой около 200-220 кДа (рис. 1Д).

Отсутствие каких-либо структурных данных о белках из С. simula не позволяет сравнить их с известными ТТХ-связывающими белками, однако данные о молекулярной массе дают возможность соотнести их с массой ранее исследованных соединений. Так, Матсуи с соавторами [13] впервые обнаружили в плазме крови T. niphobles ТТХ-связывающий белок, который обладает наименьшей массой среди остальных впоследствии выделенных белков -116 кДа по данным ДСН-ПААГ-электрофореза и 91 кДа по данным масс-спектрометрии. Позже из плазмы крови T. pardalis Йотсу-Ймашита с коллегами [17] выделили димерный белок PSTBP, образованный двумя нековалентно связанными мономерами массой 104 кДа. Мономеры PSTBP представляют собой кислые гликопротеины (pI=5,0), которые состоят из белковой части массой 42 кДа и N-гли-кана массой 62 кДа. Гомологи PSTBP, обнаруженные у других видов фугу, отличаются, в основном, по составу и размеру N-гликана. В зависимости от вида животного молекулярные массы гомологов PSTBP варьируют в пределах от 105 кДа до 140 кДа. ТТХ-связывающие белки, выделенные из морских беспозвоночных, отличаются бóльшими молекулярными массами, чем белки, выделенные из рыб фугу. Нагашима с соавторами [18] впервые обнаружили в гемолимфе краба H. sanguineus ТТХ-связывающий белок массой около 400 кДа. Белок представляет собой кислый гликопротеин (pI=3,5), состоящий, как минимум, из субъединиц двух типов - массой 72 кДа и 82 кДа. Из токсичных брюхоногих моллюсков Natica lineata Хванг с коллегами [19] выделили самый большой из известных ТТХ-связывающих белков массой около 400 кДа, состоящий из субъединиц двух типов - 272 кДа и 47 кДа, соответственно. Таким образом, установленная молекулярная масса белков из C. simula находится в диапазоне от 105 кДа у рыб T. niphobles до 400 кДа у морских беспозвоночных H. sanguineus и N. lineata .

Выводы: немертины C. simula содержат белки с молекулярной массой 200-220 кДа, обладающие ТТХ-связывающией активностью, и могут являться перспективным объектом для поиска природных антидотов против ТТХ и токсинов гуанидинового ряда.

Исследование выполнено при поддержке ДВФУ, проект №14-08-06-19_и. и программы фундаментальных научных исследований «Дальний Восток» №15-1-3-036.