Исследование биодеградируемых матриц, изготовленных для сердечно-сосудистой хирургии

В сердечно-сосудистой хирургии широко применяют протезы сосудов малого диаметра, искусственные клапаны сердца, сердечно-сосудистые заплаты, стенты, которые изготавливают главным образом из полимеров (полиэфиров, полиуретанов, полиолефинов, полиамидов, фторполимеров) [7]. Трендом последних лет является разработка изделий на основе биодеградируемых полимеров, таких как полиоксиалканоаты, полилактиды и т.п.

В то же время, несмотря на достигнутые успехи в области синтеза и модификации полимерных материалов, большинство исследователей считают, что на данный момент ни один из них не отвечает полностью всем требованиям, которые предъявляются к материалам, рассчитанным на длительный контакт с кровью [1–5]. Они должны обладать комплексом специфических свойств: биосовместимостью, тромборезистентностью, антимикроб-ностью, оптимальными прочностными характеристиками [3].

Для оценки безопасности использования полимеров проводят эксперименты in vivo. Главным критерием, который используется при оценке биосовместимости имплантируемого материала, является тканевая реакция на имплантат [6]. Он должен функционировать в организме в течение заданного периода времени, исходя из места имплантации.

Процесс замещения имплантата живой тканью состоит из двух этапов, которые заключаются в биодеградации полимерной конструкции и регенерации ткани, причем их скорость должна в значительной степени совпадать. Именно поэтому изучение согласованности данных процессов является важным этапом разработки полимерных композиций для хирургии. Путем подбора комбинаций биодеградируемых полимеров и разработок новых технологий изготовления изделиям для сердечно-сосудистой хирургии придаются необходимые свойства [7].

Цель работы: оценить изменения морфологической структуры и динамики деградации биодеградируемых полимерных матриц, имплантированных лабораторным животным.

Материал и методы

Для эксперимента были изготовлены образцы матриц из биодеградируемых полимеров: ПГБВ и полимерных композиций ПГБВ+поли-D,L-лактид и ПГБВ+поликапро-лактон (“Sigma-Aldrich”). ПГБВ с молекулярной массой 404 кД был синтезирован в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино).

Добавление полимеров поли-D,L-лактида (PLA) и поликапролактона (PCL) проходило в объеме 10% по массе полимера. В качестве растворителя использовали хлороформ.

Матрицы получали двумя способами: методом полива и методом электроспиннинга. Первый метод – полив 3%-го раствора полимера в хлороформе на обезжиренную поверхность стекла с последующим испарением растворителя. Второй метод – метод электроспиннинга – Nanon-01А (MECC Inc., Япония). Параметры электроспиннинга: 8%-й раствор полимера, напряжение 18 Кв, скорость подачи раствора 0,4 мл/ч. Методом полива было изготовлено 6 образцов (по 2 образца ПГБВ, ПГБВ/PLA, ПГБВ/PCL). Методом электроспиннинга было также приготовлено 6 образцов матриц аналогичного состава. Всего было изготовлено 12 образцов. Размеры готовой матрицы – 5х4 см.

Эксперименты проводили на самцах крыс линии Wistar. Для изучения динамики биодеградации in vivo образцы имплантировали крысам весом 80–100 г подкожно на сроки 30, 60 суток, по 10 животных на точку. Всего было прооперировано 60 животных. Вдоль позвоночника производили по 2 разреза длиной 0,5 см, тупым способом формировали слепой канал длиной 1,5–2,0 см, куда помещали образец матрицы размером 7х7 мм. Всего было имплантировано 120 образцов матриц, т.е. 60 шт., приготовленных методом полива, и 60 шт., приготовленных методом электроспиннинга.

После окончания эксперимента образцы иссекали вместе с окружающими тканями, проводили фиксацию в 4%-м растворе нейтрального формалина с последующим заключением в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван Гизон, изучали на световом микроскопе “AXIO Imager.A1” (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 100, 200, 400 раз.

Все манипуляции с животными проводили под ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ № 1179 Минздрава СССР от 10.10.1983 г., Приказ № 267 Минздрава РФ от 19.06.2003 г.).

Результаты и обсуждение

При удалении материала из подкожных карманов не было отмечено ни одного случая репозиции исследуемых образцов, также отсутствовала местная воспалительная реакция со стороны окружающих тканей.

При гистологическом изучении эксплантированных матриц наблюдали воспалительную реакцию в тканях, окружающих образцы из ПГБВ и ПГБВ+PLA, которая была однотипна и проявлялась в виде умеренной и очаговой лимфогистиоцитарной инфильтрации.

Образцы ПГБВ+PLA и ПГБВ+PCL были слабо спаяны с окружающими тканями и окружены тонкой фиброзной капсулой, что согласуется с литературными данными. Формирование капсулы вокруг имплантированного материала обусловлено естественной реакцией организма на инородное тело. Матрицы на основе биополимеров, как и любое инородное тело, покрываются валом из лейкоцитов: сначала нейтрофилов и лимфоцитов, далее эти клетки заменяются моноцитами и макрофагами, постепенно туда мигрируют фибробласты, которые дифференцируются в фиброциты и продуцируют коллаген. В итоге матрица вместе с макрофагальным валом покрывается соединительнотканной капсулой.

Матрицы, приготовленные методом электроспиннинга, обладали более высокими темпами биодеградации в отличие от матриц аналогичного состава, приготовленных методом полива. Через 30 суток после имплантации образцы матриц (полив) ПГБВ (n=10) и ПГБВ+PLA (n=10) сохраняли целостность структуры пленки в капсуле, признаки деградации образцов отсутствовали. В то же время матрицы, приготовленные из данных полимеров методом электроспиннинга (n=20), подверглись значительной деструкции: образцы обладали рыхлой структурой, граница матрицы и фиброзной капсулы практически отсутствовала, в толще образца присутствовали коллагеновые волокна, визуализировались ядра фибробластов. Наличие этих структур свидетельствует о биодеградации матрицы, происходит замещение волокон мембраны соединительной тканью. Деградация матриц ПГБВ+PCL происходила неравномерно и существенно медленнее как в случае полива (n=10), так и в случае метода электроспиннинга (n=10).

Через 60 суток после имплантации матрицы ПГБВ+PCL, изготовленные методом электроспиннинга (n=10), фрагментарно заполнялись соединительной тканью. Образцы того же состава (n=10), изготовленные методом полива, практически не замещались соединительной тканью. Наиболее выраженная воспалительная реакция в течение всего периода наблюдения отмечалась при имплантации матриц на основе гомополимера (ПГБВ), n=20.

Образцы, имеющие в своем составе два полимера, продемонстрировали в ходе эксперимента лучшие био-совместимые свойства. Состав матриц влияет на скорость биодеградации: добавление PLA в состав матриц на основе ПГБВ приводит к снижению сроков деградации, а добавление PCL замедляет темп деградации.

Выводы

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что биосовместимые свойства матриц зависят от состава композиции, а также от способа получения.

Образцы, приготовленные методом электроспиннинга, обладали более высокими темпами биодеградации, в то время как матрицы того же состава, приготовленные методом полива, обладали низкой скоростью деградации.

Включение PLA в состав матриц на основе ПГБВ позволяет сократить сроки деградации, а добавление PCL замедляет скорость деградации матрицы.

Результат оценки морфологической структуры тканей, окружающих матрицы, показал минимальную ответную реакцию организма на имплантацию, которая является закономерной физиологической реакцией.