Исследование биологической активности медного хелата при экспериментальной постгеморрагической анемии у белых крыс

Введение. Железодефицитная анемия относится к наиболее распространенным заболеваниям нашего времени [2, 13]. Патогенез алиментарной железодефицитной анемии связан с угнетением кроветворения на фоне ферментативных особенностей организма, в результате чего развивается смешанная гипоксия, влекущая за собой метаболические и функциональные нарушения в клетках, тканях и органах [3, 11, 12]. Неслучайно Gaidos подчеркивал, что «по своей цене железо не является драгоценным металлом. Но оно, безусловно, драгоценно по своей роли в истории и еще более по своему значению для живых существ» [11].

К железодефицитной анемии приводит, наряду с дефицитом железа, необеспеченность организма такими микроэлементами, как медь, йод, кобальт, марганец и др. Из них наиболее важна медь, участвующая в процессах кроветворения, в частности в синтезе гемоглобина, а также способствующая достаточному уровню абсорбции железа из желудочно-кишечного тракта в кровь. Вследствие недостатка меди, железо начинает усваиваться хуже, вызывая дополнительную депрессию синтеза гемоглобина, что ведет к усугублению анемии на фоне гипокупремии и гипо-фергемии [6]. Важное значение в повышении биологической доступности минеральных веществ и обеспеченности организма микроэлементами придается хелатным соединениям. В сочетании с органическими соединениями активность микроэлементов возрастает в сотни и тысячи раз по сравнению с их ионным состоянием [4]. Согласно данным ряда авторов, биологическая доступность меди из аминокислотных хелатов значительно выше, чем из сернокислой меди [4, 6]. В данной работе протестирована активность тиро-зината меди в сочетании с Fe-содержащим соединением при экспериментальной постгеморрагической анемии у белых крыс.

Цель исследования. Исследование биологической активности тирозината меди при экспериментальной постгеморрагической анемии у белых крыс.

Материалы и методы. Проведен направленный синтез хелатного комплексного соединения тирозина с медью. Полученный препарат полностью соответствует теоретическим предпосылкам как по стехиометрии-ческому, так и по структурному строению. Содержание меди в препарате составляет 15,3 %. Структура тирозината меди доказана методом длинноволновой инфракрасной (ИК)-спектроскопии по линиям 357,29 см-1. Полученный хелат представляет собой бле- стящие фиолетового цвета кристаллы, малорастворимые в воде, стойкие в слабощелочной среде и разлагающиеся в кислой [5].

Экспериментальными животными послужили нелинейные белые крысы. Опыты проведены на модели постгеморрагической анемии белых крыс. С этой целью 21 половозрелого самца 180-дневного возраста и массой

180–200 г взвешивали, двукратно (в течение двух дней) обескровливали на 40 % от общего объема крови, используя хвостовую вену. Крыс содержали в теплом помещении, давали обильное питье, кормили по стандартному рациону для лабораторных животных. Схема опыта приведена в табл. 1.

Таблица 1

Группа	Количество животных	Инъекции и дозы
I (контроль)	7	1.    0,9 % NaCl – 0,5 мл, в/м 2.    0,9 % NaCl – 0,5 мл, в/м
II (ферродекс)	7	1.    Ферродекс – 0,5 мл, в/м (37,5 мг Fe) 2.    Ферродекс – 0,5 мл, в/м (37,5 мг Fe)
III (тирозинат меди)	7	1.    Ферродекс – 0,5 мл, в/м (37,5 мг Fe) 2.    Тирозинат меди – 0,5 мл 0,16 % р-р, в/м (0,03 мг Cu)

Схема проведенного эксперимента

В течение трех дней инъекции были сделаны двукратно. Животным контрольной группы вводили внутримышечно физиологический раствор по 0,5 мл во внутреннюю часть бедра; крысам второй группы – двукратно ферродекс по 0,5 мл; животным третьей группы вторую инъекцию ферродекса заменяли инъекцией тирозината меди, используя 0,16 % раствор.

В течение экспериментального периода наблюдали динамику содержания в крови гемоглобина, эритроцитов, величины гематокрита. Гематологические показатели определяли по общепринятым методикам. Содержание гемоглобина определяли гемометром типа Сали (ГС-2). Для подсчета количества эритроцитов кровь набирали в смесители для эритроцитов в разведении 1:200 на изотоническом растворе NaCl и считали в камере Горяева. Величину гематокрита определяли в капиллярах после центрифугирования при 3000 об/мин в специальном считывающем устройстве.

Кровь для исследования брали из хвостовой вены в следующие периоды: в начале опыта (до каких-либо воздействий), спустя три дня после обескровливания, на 10-й день после проведенных инъекций, в конце эксперимента (на 30-й день после инъекций).

Кровь брали утром перед кормлением и исследовали немедленно.

В сыворотке крови определяли активность церулоплазмина по методу Х. Ревина (1961) в различные сроки: в начале опыта, после второго кровопускания, на 10-й и 30-й дни после инъекций препаратов. Общий белок в сыворотке крови определяли рефрактометрическим методом. Расчет содержания белка проводили по таблице, разработанной Д.Ф. Пресняковым. Определение содержания белка и белковых фракций в сыворотке крыс на 10-й день после введения препаратов производилось по методу С.А. Карнюка.

Исследования проведены в лабораторииях кафедры химии Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии им. П.А. Столыпина, кафедры биохимии Казанского научно-исследовательского ветеринарного института, кафедры спектроскопии УлГУ, кафедры морфологии УлГУ, кафедры спектрального анализа НИИ атомных реакторов (г. Димитровград), кафедры общей патологии ВНИВИПФиТ (г. Воронеж).

Результаты и обсуждение. Для синтеза тирозината меди с целью его дальнейшего изучения разработаны технологический регламент производства и технические условия на препарат [5].

Полученные кристаллы тирозината меди исследовались методом ИК-спектроскопии на спектрофотометре Specord M-80 в таблетках KBr.

Полученные нами результаты подтверждают предположения о хелатной природе связи тирозина и меди в комплексе. ИК-спектроскопия является одним из информативных методов в изучении биологических соединений. Анализ литературных данных по исследованию спектров аминокислот позволяет судить о малой изученности соединений металлов с аминокислотами методом ИК-спектроскопии [7, 9, 12]. Ценность инфракрасной спектроскопии обусловлена тем, что вид колебаний каждой функциональной группы очень чувствителен к малейшим изменениям химической структуры, конформации и окружения.

С целью подтверждения биологической активности полученного соединения нами исследовались показатели красной крови в группах контрольных и опытных животных. Вторым контролем послужила группа белых крыс, которым на фоне постгеморрагической анемии вводили железосодержащий препарат ферродекс.

Гематологические показатели крови крыс до применения и на фоне применения различных препаратов представлены в табл. 2. В результате кровопускания картина красной крови изменилась. Уровень гемоглобина снизился во всех трех экспериментальных группах: в I – на 2,5 %, во II – на 3,4 %, в III – на 3,3 %. Аналогично снизилось количество эритроцитов и показатель гематокрита. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вызванной постгеморрагической анемии у животных.

В III группе животных с постгеморрагической анемией, получающих тирозинат меди и ферродекс, количество гемоглобина к 10-му дню возросло на 8,4 %, число эритроцитов – на 2 %, гематокритный показатель – на 14,3 %.

Восстановительная активность организма крыс, получающих медный хелат, превышала в среднем таковую контрольных животных второй группы в 3 раза. Полученные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии меди в сочетании с железом на эритро- и гемопоэз и согласуются с данными литературы [1, 3, 6].

На 10-й день от начала кровопускания количество общего белка в крови животных второй контрольной группы, которым дважды вводили ферродекс, и третьей опытной группы, инъецированных ферродексом и ти-розинатом меди, было приблизительно одинаковым (8,28±0,01 и 8,25±0,01 г% соответственно). Достоверность различий в содержании альбуминов и глобулинов статистически не установлена (табл. 3). Альбуминовая фракция опытной группы превосходила контрольную на 15,1 %. Содержание аль-фа-глобулинов опытной группы составило 20,23±4,64 % (2,16±0,38 г%), что на 4 % меньше количества этой фракции в контрольной группе. По бетта-глобулинам к 10-му дню после введения препаратов различий между экспериментальными группами выявлено не было (28,68±6,59 и 28,77±11,36 %). Более высокий уровень гамма-глобулинов отмечен у крыс второй контрольной группы (22,07±5,29 %) в сравнении с опытной группой (19,73±8,04 %). Альбуминово-глобулино-вый коэффициент имел обратно пропорциональную зависимость от гамма-глобулинов и составил для второй контрольной группы 0,28, для опытной – 0,34. Отсюда следует, что тирозинат меди нормализирует общее состояние животных и общую неспецифическую реактивность организма.

Изучение содержания цирулоплазмина в сыворотке крови крыс с постгеморрагической анемией позволило установить, что инъекции тирозината меди способствуют его повышению с 1-го по 30-й день эксперимента (табл. 4). Так, к 10-му дню количество церулоплазмина у опытных крыс составило 42,4±5,1 мг%, что на 6,8 % больше, чем во II группе, и на 4,7 % больше, чем в I. К концу наблюдения активность фермента становится приблизительно одинаковой и составляет соответственно группам 51,5±6,87, 50,9±6,9 и 52,4±4,77 мг%.

Таблица 2

Группа животных

Гемоглобин, г%

Эритроциты, млн/мм3

Гематокрит, %

Начало

3-й день

10-й день

30-й день

Начало

3-й день

10-й день

30-й день

Начало

3-й день

10-й день

30-й день

I (без введения препаратов)

13,7±1,18

11,2±0,52

13,3±0,83

16,1±0,69

6,61±0,49

4,93±0,13

6,27±0,12

7,67±0,68

40,8±0,25

30,8±0,24 *

44,8±0,25

50,0± 1,48

II (ферродекс + ферродекс)

14,7±0,30

11,3±0,29

15,4±0,32

15,6±0,14

6,64±0,27

4,47±0,16

6,87±0,14

7,01±0,23

41,3±0,27

28,4±0,25

55,9±0,34

45,4±2,28

III (ферродекс + тирозинат меди)

14,6±0,34

11,3±0,48

16,7±0,43 * +++

16,0±0,46

6,72±0,25

4,28±0,14 *

7,0±0,19 *

7,6±0,38

40,9±0,26

26,6±0,24

52,1±1,26 **

51,9±1,21 * ** +++

Примечание. * – p <0,01; ** – p<0,001 при сравнении I и III групп; ⁺⁺⁺ – p<0,05 при сравнении II и III групп.

Таблица 3

Группа животных	Общий белок, г%	Альбумины		Глобулины						Альфа-глобулиновый индекс
		%	г%	альфа-		бета-		гамма-
				%	г%	%	г%	%	г%
II (ферродекс + ферродекс)	8,28±0,01	21,96±0,7	1,82±0,01	27,29±1,74	2,26±0,14	28,68±6,29	2,37±0,56	22,07±5,29	1,83±0,44	0,28
III (ферродекс + тирозинат меди)	8,25±0,01	25,27±4,41	2,09±0,37	26,23±4,64	2,16±0,38	28,77±11,36	2,37±0,94	19,73±8,04	1,63±0,67	0,34

Гематологические показатели крыс на фоне применения различных препаратов

Показатели белковых фракций крови крыс на фоне применения различных препаратов

Таблица 4

Группа животных	Количество церулоплазмина, мг%
	на 3-й день после кровопускания	на 10-й день после кровопускания	на 30-й день после кровопускания
I (физ. раствор)	36,11±6,16	40,51±7,29	51,50±6,87
II (ферродекс + ферродекс)	35,83±4,73	36,32±4,68	50,91±6,90
III (ферродекс + тирозинат меди)	42,62±7,56	42,45±5,11	52,41±4,77

Активность церулоплазмина в сыворотке крови крыс на фоне применения различных препаратов

Результаты исследования показали, что при постгеморрагической анемии наблюдается повышение активности церулоплазмина. Наши данные по этому вопросу полностью согласуются с результатами, полученными Э.В. Тен [10]. Однако, по данным других авторов, введение хелатных соединений меди вызывает снижение активности церулоплазмина в сыворотке крови крыс [8].

Заключение. Разработанный способ высокотемпературного синтеза хелаткомплекса меди с тирозином позволяет получить препарат, являющийся стимулятором кроветворения в организме животных. Структура комплекса доказана методом длинноволновой ИК-спектроскопии. При изучении биологической активности полученного препарата выявлено, что под влиянием тирозината меди в сочетании с ферродексом в крови анемичных животных наблюдается активное повышение уровня гемоглобина. Улучшение картины красной крови неизменно сопровождается повышением резистентности организма, что отражается на содержании белковых фракций крови и альбумино-глобулинового показателя. Активность основного медьпро-теина крови церулоплазмина при введении тирозината меди повышается на 4,7 % к 10-му дню после инъекции.

• 1.    Абдурахманов Г. М. Экологические особенности содержания микроэлементов в организме животных и человека / Г. М. Абдурахманов, И. В. Зайцев. – М. : Наука, 2004. – 280 с.

• 2.    Анохин Б. Опыт лечения телят-молочников при алиментарной анемии / Б. Анохин,

  Н. Макринова, В. Шушлебин // Молочное и мясное скотоводство. – 2003. – № 2. – С. 32–33

• 3.    Воробьев П. А. Анемический синдром в клинической практике / П. А. Воробьев. – М. : Ньюдиамед, 2001. – 168 с.

• 4.    Денисова О. Ф. Исследование антиане-мических свойств хелатного соединения меди с тирозином при клинической железодефицитной анемии поросят-сосунов / О. Ф. Денисова // Материалы Первого съезда ветеринарных фармакологов России / Всерос. науч.-исслед. ветеринар. ин-т патологии, фармакологии и терапии. – Воронеж, 2007. – С. 234–237.

• 5.    Денисова О. Ф. Исследование комплексов тирозината меди методом ИК-спектроскопии / О. Ф. Денисова, А. С. Хромов // Научные труды Ульяновского политехнического ин-та. Вещество и поле. – Ульяновск, 1991. – С. 52–57.

• 6.    Завалишина С. Ю. Дефицит железа у телят и поросят / С. Ю. Завалишина, Е. Г. Краснова, И. Н. Медведев // Вестн. Оренбургского гос. унта. – 2011. – № 15 (134). – С. 55–58.

• 7.    Маркин А. В. Возможности спектроскопии комбинационного рассеяния применительно к анализу наноструктурированных объектов : авто-реф. дис. … канд. хим. наук / А. В. Маркин. – Саратов, 2013. – 19 с.

• 8.    Николаев М. Г. Диагностика и профилактика анемии и иммунной недостаточности у поросят : автореф. дис. … канд. вет. наук / М. Г. Николаев. – Витебск, 2002. – 32 с.

• 9.    Сильверстейн Р. Спектрометрическая идее нтификация органических соединений / Р. Силь-верстейн, Г. Басслер, Т. Морри. – М. : Мир, 1997. – 590 с.

• 10.    Тен Э. В. Биохимические показатели у животных в эксперименте с хелатными комплексами меди / Э. В. Тен // Профилактика и ликвидация болезней домашних животных и птиц. – Ульяновск : УСХИ, 1980. – С. 68–72.

• 11.    Casassus P. Iron-deficiency anemia. Etiology. Physiopathology / P. Casassus // Rev. praf. – 2001. – № 2. – Р. 209–213.

• 12.    Clark S. F. Iron deficiency anemia         13. Killi P. S. Iron Deficiency Anemia

  / S.F. Clark // Nutr Clin. Pract. – 2008. – № 23 (2). – / P. S. Killi, M. D. Bennett // American Family Р. 128–141.                                           Physician. – 2007. – № 75 (5). – Р. 671–678.

THE STUDY OF BIOLOGICAL ACTIVITY THYR-CU CHELATEIN WHITE RATS WITH EXPERIMENTAL POSTHAEMORRAGIC ANEMIA

Ulyanovsk State Universyty