Исследование целлюлозолитической активности цекальных бактерий у кроликов методом in vivo

позволяет оценить лишь титр целлюлозолитических бактерий в слепой кишке , а не фактическую динамику целлюлозолитической активности . В наших опытах при увеличении уровня клетчатки в рационе кроликов целлюлозолитическая активность , изучаемая данным методом , повышалась , что не соответствовало изменениям показателя переваримости клетчатки .

Другой метод – вискозиметрический был предложен исследователями в области биокатализа и заключается в оценке изменения вязкости раствора карбоксиметилцеллюлозы при добавке ферментного препарата [3]. По этой методике определяется только один из ферментов целлюлазного комплекса – эндоглюконаза ( К . Ф . 3.2.1.4), начинающая гидролиз целлюлозы . Как показали наши исследования на кроликах , это типичный адаптивный фермент , активность которого прямо пропорциональна поступлению субстрата и не позволяет выявить динамику сочетанного действия целлюлаз .

Большинство известных методов определения целлюлозолитической активности in vivo разработано для изучения ее в преджелудках жвачных животных [4]. Содержимое преджелудков имеет существенные физико-химические отличия от химуса слепой кишки кроликов. Так, если у жвачных содержимое рубца включает крупные частицы корма и свободную жидкую фракцию, то у кроликов пищевые массы, дошедшие до слепой кишки, находятся в гомогенном мелкодисперсном состоянии, а жидкая фаза не отделяется, что затрудняет изучение целлюлозолитической активности у кроликов подобными методами.

Для более адекватной оценки особенностей целлюлозолитической активности микрофлоры у кроликов в зависимости от биохимического состава рациона , уровня клетчатки , ее источников и способов скармливания , нами была разработана оригинальная методика вживления хронических фистул слепой кишки у кроликов и изучения целлюлозолитической активности цекальных микробов методом in vivo [5].

По нашей методике канюли изготовляются из задней части пластикового одноразового шприца ( объемом 5 см ³) длиной 3,5 см , снабженной фаской , стачиваемой до размера 3 мм . Кролик надежно фиксируется в станке , в нижней трети живота подготавливается операционное поле , местный наркоз осуществляется раствором новокаина по Вишневскому . Канюля внедряется в разрез слепой кишки со стороны фаски и закрепляется кисетным швом . Мышцы и брюшина зашиваются кетгутом , кожа – капроновой нитью . Для фиксации канюли на ее наружную выступающую часть приклеивается пластмассовая трубка большего диаметра . После операции на животных надеваются специальные фартуки во избежание травмирования операционного поля .

Методика определения целлюлозолитической активности состоит в следующем : источник целлюлозы ( предварительно высушенная гофрированная полоска обеззоленного фильтра « синяя лента ») помещается в капсулу , выполненную из отрезка поливинилхлоридной трубки , запаянную с одного конца , длиной 30 и диаметром 7 мм , снабженную 4 продольными отверстиями . Такая продольная перфорация обеспечивает наилучший контакт источника целлюлозы с химусом и высокую воспроизводимость значений показателя . Капсула на капроновой нити вводится в слепую кишку через канюлю , всегда на постоянную глубину . Конец нити крепится к наружному диску канюли . Целлюлозолитическая активность выражается в процентах убыли массы источника целлюлозы за время инкубации .

Нами определено также оптимальное время инкубации . Как показали наблюдения , после 24 часового пребывания источников целлюлозы в слепой кишке они сильно деструктурируются , и в процессе отмывания отмечались существенные потери их массы . Более стабильные показатели были получены при 12 часовой экспозиции , которая и использовалась в дальнейших анализах .

Опыты по изучению влияния уровней клетчатки на целлюлозолитическую активность цекальной микрофлоры и переваримости этого нутриента проводились на 10 взрослых кроликах с хронической фистулой слепой кишки методом периодов продолжительностью по 16-18 суток каждый . Ж ивотные находились на зимних рационах , состоящих из концентратов , сена и корнеплодов и содержащих в 1, 2, 3, 4, 5 периодах опыта 12,8; 14,4;

16,0 ( контроль ); 17,6 и 19,2 % клетчатки соответственно . Указанные уровни клетчатки достигались изменением соотношения в рационе концентратов и сена . Данные по целлюлозолитической активности представлены в таблице .

Таблица – Целлюлозолитическая активность микрофлоры слепой кишки у кроликов в зависимости от уровня клетчатки в рационе

Выявленная эмпирическая зависимость между активностью и концентрацией клетчатки в рационах с высокой степенью точностью (R² = 0,97) аппрокси мируется степенной функцией y = 1272,3 x ^-1,69 Данные , полученные этим методом достоверно коррелируют с коэффициентами переваримости клетчатки различных рационов (r = 0,938, р < 0,01). Взаимосвязь между этими двумя показателями изображена на рисунке .

кишки in vivo, %

Рисунок – Зависимость переваримости клетчатки от целлюлозолитической активности в слепой кишке

Таким образом , несмотря на относительную трудоемкость , предложенный нами метод определения целлюлозолитической активности микрофлоры у кроликов более приемлем для физиологических исследований , чем традиционные методики и позволяет определить суммарную активность ферментов целлюлазного комплекса in vivo, а также прогнозировать переваримость клетчатки и других питательных компонентов кормов .