Исследование действия ионизирующего излучения на радиационно- индуцируемые изменения клеток системы крови мышей на уровне организма

В настоящее время в ряде работ [1-3] показано, что ионизирующая радиация вызывает широкий спектр изменений в клеточном составе периферической крови животных (мышей). Показано, что биологические эффекты в клетках после действия ионизирующего излучения (ИИ) обусловлены повреждением ядерной ДНК, нарушениями в системе репарации ДНК, что реализуется в повышении хромосомных аберраций и индукции других неблагоприятных эффектов. У клеток,

Когарко И.Н. – вед. науч. сотр., д.м.н.; Петушкова В.В .* – вед. спец., к.э.н.; Когарко Б.С. – ст. науч. сотр., к.ф.-м.н.; Нейфах Е.А. – ст. науч. сотр., к.б.н.; Ктиторова О.В. – науч. сотр., к.б.н.; Ганеев И.И. – инж.-исслед.; Пелевина И.И. – д.б.н. ФГБУН ФИЦ ХФ РАН. Пряхин Е.А. – зав. отд., д.б.н.; Андреев С.С. – ст. науч. сотр., к.б.н. ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России. Кузьмина Н.С. – ст. науч. сотр., д.б.н. ФГБУН ФИЦ ХФ РАН, ФГБУН ИОГен РАН. Селиванова Е.И. – ст. науч. сотр., к.б.н. ФГБУН ФИЦ ХФ РАН, МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

которые находятся рядом с облучёнными клетками или в культуральной среде от облучённых клеток, также могут наблюдаться изменения, схожие с обнаруженными в облучённых клетках.

Так называемые «немишенные эффекты» ИИ, включая «эффекты свидетеля», изучены in vitro и in vivo [4, 5]. Показано, что «эффекты свидетеля» характеризуются не только переносом повреждений от облучённых клеток к необлучённым в виде хромосомных аберраций, генных мутаций, изменения экспрессии генов, но и апоптозом, неопластической трансформацией клеток-«свидетелей».

Существование радиационно-индуцированного «эффекта свидетеля», при котором необлу-чённые клетки проявляют реакции, сходные с характерными для облучённых при воздействии облучённых клеток или кондиционированной среды от облучённых клеток, было рассмотрено в тех же работах Coates et al. (2004) [4], Matsumoto et al. (2004) [5] и другими. Ранее считалось, что «эффект свидетеля» может реализовываться только в отдельных клетках в пределах одного органа или системы. Недавно было показано, что «эффект свидетеля» может быть зарегистрирован не только в клеточных культурах или in vivo в одном организме, но и на межорганизменном уровне, облучённый организм может индуцировать изменения у необлучённого организма [6-9].

Дистанционный «эффект свидетеля» - наименее изученный с точки зрения проявлений и механизмов феномен, относящийся к «немишенным эффектам». В рамках комплексного проекта по оценке радиационно-индуцированных «немишенных эффектов» в работах [10-15] приведены результаты наших исследований. В нашем предыдущем эксперименте [10, 11] у необлучённых мышей, находившихся на протяжении 3 мес. в контакте с облучёнными (3 Гр) особями, выявлены признаки изменений, сходных с радиационно-индуцированными. Отмечались изменение поведенческих реакций, статистически значимая тенденция к уменьшению веса селезёнки (r=-0,416; p=0,048), повышению площади алопеции (r=-0,631; p=0,001) и иные аномалии.

В другой работе [13] было показано, что у необлучённых мышей при их совместном содержании с облучёнными животными вне зависимости от наличия или отсутствия перегородки повышение частоты нормальных хроматофильных (оксифильных) эритроцитов с микроядрами по сравнению с показателем в биологическом контроле, которые можно было интерпретировать как «эффект свидетеля». У облучённых животных получен так называемый «эффект спасения» на тех же эритроцитах разной степени зрелости в периферической крови у мышей.

В работе [14] был проведён анализ состояния кроветворных органов (костный мозг, селезёнка и тимус), включивший в себя исследование количества ядерных клеток в них, а также оценку массы селезёнки и тимуса. Полученные результаты говорят о наличии «эффекта свидетеля» в ядросодержащих клетках костного мозга мышей.

Целью настоящего исследования является изучение радиационных «эффектов свидетеля» и «эффектов спасения» на уровне организма у облучённых и необлучённых животных при их совместном содержании при использовании лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови мышей.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 60 беспородных мышах-самках. В опыте использовали здоровых животных, не подвергавшихся ранее другим экспериментальным воздействиям. Группы формировали методом сплошной выборки. При проведении экспериментальных процедур соблюдались соответствующие международные правила работы с животными [16, 17]. Животные (n=20) были облучены в дозе 3 Гр на исследовательской радиобиологической гамма-установке

ИГУР-1М с четырьмя источниками 137Cs, мощность дозы 0,79 Гр/мин, неравномерность γ-поля в рабочем пространстве не более 5%. Поглощённая доза для мышей составила 3,0 Гр.

Мыши были рассажены в четыре клетки, в каждой из которых находилось по пять облучённых мышей и по пять необлучённых (мыши-«свидетели»). В двух из четырёх клеток облучённые и необлучённые мыши могли свободно контактировать друг с другом. В двух других клетках мыши облучённой и необлучённой групп были разделены металлической сеткой, что исключало их тактильный контакт. Для контроля были использованы: группа биоконтроля (n=10) и группа облучённых животных (n=10), каждая из которых содержалась в отдельной клетке. Было получено 6 экспериментальных групп. Эксперимент продолжался 3 мес.

Кровь из хвостовой вены мышей отбирали на 3-и, 7-е, 14-е, 30-е, 60-е и 90-е сут после начала эксперимента. Кровь в объёме 8 мкл использовали для подсчёта количества лейкоцитов с помощью гемоцитометра Пикоскель PS-4. Для анализа формулы крови подсчитывали 200 лейкоцитов.

Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Различия принимали статистически значимыми при вероятности 0-гипотезы р<0,05. Для оценки влияния различных факторов на анализируемые показатели проводили многофакторный дисперсионный анализ в обобщённой линейной модели. Оценивали влияние следующих воздействующих факторов: гамма-облучение; срок после начала эксперимента; «фактор контакта» – вид контакта между облучёнными и необлучёнными животным (0 – отсутствие контакта между облучёнными и необлу-чёнными животными; 1 – обонятельный контакт (с перегородкой); 2 – тактильный и обонятельный контакт (без перегородки).

Результаты

Известно, что острое гамма-облучение приводит к снижению количества лейкоцитов в периферической крови у млекопитающих. В представленных экспериментах после острого гамма-облучения в дозе 3 Гр уже через 3 сут в периферической крови регистрировалось статистически значимое снижение количества лейкоцитов более чем в 5 раз (рис. 1). С увеличением времени после облучения происходило восстановление количества лейкоцитов в периферической крови и на 60е сут этот показатель практически не отличался у облучённых животных по сравнению с показателем в группе биологического контроля. Следовательно, облучение приводит к снижению количества лейкоцитов в периферической крови, показатель повышается в зависимости от времени после начала эксперимента, что отражает его пострадиационное восстановление.

У необлучённых животных-«свидетелей» не было выявлено статистически значимых отклонений от группы биологического контроля, однако при совместном пребывании с облучёнными животными у необлучённых животных в клетке без перегородки проявляется тенденция к относительному уменьшению числа лейкоцитов на 3-и сут и в отдалённый период времени на 30-е и 60-е сут после облучения (рис. 2). При наличии в клетке перегородки также наблюдается относительное уменьшение числа лейкоцитов на 3-и, 14-е, 30-е, а также 90-е сут. Этот результат, по-видимому, можно считать «эффектом свидетеля» у необлучённых животных, показанном на графике (рис. 2), где линия, соответствующая результатам «эффекта свидетеля», находится ниже линии контроля.

Результат, показанный на рис. 3, по-видимому, можно считать «эффектом свидетеля» у необлучённых животных. У облучённых животных, которых содержали вместе с необлучёнными животными-«свидетелями», было зарегистрировано по сравнению с гамма-контролем снижение количества лейкоцитов при совместном нахождении с необлучёнными животными в клетке с перегородкой на 3-и, 7-е, 14-е, 60-е, а также 90-е сут, а при содержании без перегородки на 3-и, 7-е, 14-е и 60-е сут.

Рис. 1. Изменение количества лейкоцитов после острого гамма-облучения мышей в дозе 3 Гр через 3 сут.

Рис. 2. Количество лимфоцитов в динамике у необлучённых мышей при совместном пребывании с облучёнными мышами.

Проведение многофакторного анализа выявило статистически значимое влияние факторов «День» (F=8,05; p<0,001) и фактора «Облучение» (F=14,10; p<0,001). Как видно из табл. 1, коэффициент для фактора «Облучение» показывает, что в среднем гамма-облучение приводит к снижению количества лейкоцитов на 4,7 млн лейкоцитов/мл. Как видно из табл. 1, при обонятельном контакте достоверно снижалось количество лейкоцитов в периферической крови в среднем на 0,89 млн лейкоцитов/мл (t=2,17; p=0,031), при этом [Фактор контакта=2], соответствующий тактильному и обонятельному взаимодействию облучённых и необлучённых животных, не оказывал статистически значимого влияния (t=1,45; p=0,15); B – свободный член.

Рис. 3. Количество лимфоцитов в динамике у необлучённых мышей при наличии перегородки между ними и облучёнными мышами.

Таблица 1

Параметры обобщённой линейной модели при анализе влияния различных факторов на количество лейкоцитов в периферической крови у мышей

Параметр	B	t	р
Свободный член	5,72	15,08	4,8x10-4°
[Фактор контакта=0]	0,00
[Фактор контакта=1]	-0,89	-2,17	0,031
[Фактор контакта=2]	-0,59	-1,45	0,150
День	0,04	8,05	1,2x10-14
[Облучение=0]	0
[Облучение=1]	-4,71	-14,10	3,6x10-36

Рис. 4. Относительное количество лимфоцитов периферической крови в динамике после гамма-облучения мышей.

При анализе клеточного состава периферической крови было выявлено, что доля лимфоцитов в группе биологического контроля во время всего эксперимента изменялась незначительно и находилась в диапазоне от 76 до 83%. Гамма-облучение вызывало временное снижение количества лимфоцитов на 7-е сут после облучения (рис. 4). В дальнейшем, на 30-е, 60-е и 90-е сут после облучения не было выявлено статистически значимого снижения доли лимфоцитов в периферической крови.

У необлучённых животных-«свидетелей» было зарегистрировано снижение относительного количества лимфоцитов в периферической крови на 3-и, 14-е, 30-е и 60-е сут после начала эксперимента при содержании в одной клетке с облучёнными мышами без перегородки (рис. 5). Такое же снижение относительного количества лимфоцитов в периферической крови мышей было отмечено на 3-и, 7-е, 30-е и 90-е сут при содержании с облучёнными животными с перегородкой (рис. 6). По-видимому, этот результат можно считать «эффектом свидетеля» у необлу-чённых животных, представленном на графике, где линия, отвечающая за «эффект свидетеля», расположена ниже контрольной линии. Необходимо отметить также, что относительное число лимфоцитов периферической крови у необлучённых животных-«свидетелей», содержавшихся с перегородкой, на 90-е сут после облучения резко понизилось с 78,2 до 67%.

У облучённых мышей, которых содержали с необлучёнными животными-«свидетелями» в одной клетке без перегородки, по сравнению с показателем в группе облучённого контроля было зарегистрировано повышение доли лимфоцитов в периферической крови на 7-е и 60-е сут - «эффект спасения», на 14-е и 30-е сут было зарегистрировано снижение этого показателя (рис. 7). У облучённых животных, которых содержали в одной клетке с перегородкой вместе с необлучёнными животными, было зарегистрировано повышение относительного количества лимфоцитов на 3-и, 14-е и 60-е сут («эффект спасения») и снижение показателя на 30-е сут (рис. 8).

—*—СВИДОБЛ

-В-БИОКОНТРОЛЬ

Рис. 5. Относительное количество лимфоцитов периферической крови у необлучённых мышей при содержании их в одной клетке без перегородки с облучёнными мышами (гамма-облучение) в течение 90 сут.

Рис. 6. Относительное количество лимфоцитов периферической крови у необлучённых мышей при содержании их в одной клетке с перегородкой с облучёнными мышами (гамма-облучение) в динамике.

Рис. 7. Относительное количество лимфоцитов периферической крови у облучённых мышей (гамма-облучение) при содержании их в одной клетке без перегородки с необлучёнными мышами в течение 90 сут.

Таким образом, у облучённых животных, содержавшихся в клетке с перегородкой совместно с необлучёнными животными, зарегистрировано повышение относительного количества лимфоцитов, которое можно определить как «эффект спасения» в данном эксперименте.

Проведение многофакторного дисперсионного анализа показало, что фактор облучения снижает относительное количество лимфоцитов в зависимости от времени после начала эксперимента на 0,04% в день и «Фактор контакта» оказывал статистически значимое влияние на анализируемый показатель (F=6,07; p=0,0026) (табл. 2).

Рис. 8 . Относительное количество лимфоцитов периферической крови у облучённых мышей (гамма-облучение) при содержании их в одной клетке с перегородкой с необлучёнными мышами в течение 90 сут.

Таблица 2

Влияние различных факторов на количество лимфоцитов в периферической крови у мышей

Параметр	F	р
Фактор контакта	6,07	0,003
День	8,54	0,004
Облучение Фактор контакта *	0,82	0,440
Облучение	0,23	0,640

Примечания: * R2=0,062.

Таблица 3

Параметры обобщённой линейной модели при анализе влияния различных факторов на количество лимфоцитов в периферической крови у мышей

Параметр	B	t	р
Свободный член	80,73	101,20	2,3x10-255
[Фактор контакта=0]	0,00	-	-
[Фактор контакта=1]	-3,32	-3,45	6,3x10-4
[Фактор контакта=2]	-1,28	-1,30	0,190
День	-0,04	-2,92	0,004

При этом статистически значимые отличия были характерны при содержании облучённых и необлучённых мышей в одной клетке с перегородкой. Такие условия эксперимента вызывали у облучённых и необлучённых животных-«свидетелей» снижение доли лимфоцитов в периферической крови в среднем на 3,3% (табл. 3).

Обсуждение и заключение

В опубликованных данных [1, 3] было показано, что биологические эффекты в гемопоэтических клетках после действия ИИ могут быть обусловлены изменениями в геноме клеток в виде генных мутаций, изменения экспрессии генов, хромосомных аберраций, повреждений структуры

ДНК, её регенерации, изменений количества внутриклеточных активных форм кислорода, апоптоза и других явлений.

При анализе полученных в настоящем исследовании данных предполагается, что радиационно-индуцированные «эффекты свидетеля» могут быть обнаружены и на межорганизменном уровне, когда у необлучённых животных, находящихся рядом с облучёнными, также могут наблюдаться изменения, схожие с обнаруженными у облучённых животных. Для объяснения этого явления в публикациях предполагается несколько механизмов: 1) непосредственный контакт и передача повреждающих факторов; 2) выделение соединений, вызывающих изменения у необлу-чённых животных на расстоянии [13, 18]; 3) действие внеклеточной ДНК [19]; 4) действие биофотонов [8, 9] и др.

В данном исследовании при проведении многофакторного анализа было выявлено статистически значимое влияние фактора «День» и фактора «Облучение». При этом гамма-облучение приводит к снижению количества лейкоцитов в периферической крови мышей на 4,7 млн лейкоцитов в мл. Доля лимфоцитов в периферической крови мышей снижается в среднем на 3,3%. Показатель фактора времени и фактора облучения при изучении лимфоцитов также продемонстрировал снижение числа лимфоцитов.

У необлучённых животных, содержавшихся с облучёнными в одной клетке как с перегородкой, так и без перегородки, наблюдался «эффект свидетеля». У облучённых животных, содержащихся с необлучёнными в одной клетке без перегородки на 7-е и 60-е сут после облучения, и содержавшихся с необлучёнными животными в одной клетке с перегородкой на 3-и, 14-е, и 60-е сут, обнаружено повышение числа лимфоцитов по сравнению с гамма-контролем - «эффект спасения».

Мы предполагаем, что на уровне организма сочетание эффектов модификации ДНК с последующим апоптозом, другими клеточными явлениями и образованием летучих метаболитов, которые воздействуют на клетки крови индуцируют «эффект свидетеля», обратной стороной которого является «эффект спасения». Механизм происходящих процессов на уровне «клеток-свидетелей» и «клеток спасения» при межорганизменном контакте не ясен, но можно предположить, что те же вышеназванные биологические вещества, а также такие, как оксид азота, активные формы кислорода, цитокины и другие через каскад сигнальных процессов могут привести к подобным биологическим нарушениям.

Полученные результаты предполагают необходимость дальнейших исследований радиационно-индуцированных «эффекта свидетеля» и «эффекта спасения» с использованием молекулярно-клеточных методических подходов.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России (Регистрационный номер № 122040400089-6 ) за счёт субсидии, выделенной ФИЦ ХФ РАН на выполнение государственного задания, тема: «Изучение принципов структурно-функциональной организации биомолекулярных систем, разработка методов дизайна их физико-химических аналогов и создание на этой основе биологически активных препаратов нового поколения».